受體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞輸注在大鼠原位肝移植中的作用.pdf

1、肝移植是治療終末期肝病的最佳選擇，但術(shù)后排斥反應(yīng)仍是影響患者生存的主要障礙。其中急性排斥反應(yīng)則較為常見(jiàn)，約70％的肝移植患者有不同程度的急性排斥，是肝移植術(shù)后早期肝功能障礙的主要原因。急性排斥反應(yīng)又稱(chēng)細(xì)胞性排斥，是由受體T淋巴細(xì)胞被供肝樹(shù)突狀細(xì)胞的異源性抗原激活后，受體T淋巴細(xì)胞活化聚集于供肝樹(shù)突狀細(xì)胞周?chē)?，通過(guò)分泌細(xì)胞因子引起的膽管上皮及靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷。其免疫學(xué)表現(xiàn)為T(mén)hl細(xì)胞產(chǎn)生白介素-2(IL-2)、干擾素-γ(IFN-γ)等細(xì)

2、胞因子分泌增加，病理學(xué)表現(xiàn)為匯管區(qū)混合細(xì)胞浸潤(rùn)，小膽管及靜脈內(nèi)皮壞死、脫落等，以術(shù)后7-14天最為明顯。 CD4+Th細(xì)胞可分化為T(mén)h1和Th2細(xì)胞亞群，其中Th1細(xì)胞因子通過(guò)促進(jìn)同種抗原特異的細(xì)胞毒T細(xì)胞和遲發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)啟動(dòng)排斥反應(yīng)，Th2細(xì)胞因子通過(guò)刺激B細(xì)胞增殖并產(chǎn)生特異性抗體在慢性移植物排斥反應(yīng)中發(fā)揮作用。Th1/Th2兩類(lèi)細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子變化是免疫反應(yīng)的指標(biāo)，Th1細(xì)胞因子高表達(dá)可以誘導(dǎo)急性排斥反應(yīng)，而Th2細(xì)胞則

3、可通過(guò)抑制Th1細(xì)胞因子表達(dá)，下調(diào)Th1細(xì)胞的效應(yīng)從而有利于免疫耐受的建立。因此Th1/Th2細(xì)胞通過(guò)彼此產(chǎn)生的細(xì)胞因子維持體內(nèi)免疫狀態(tài)的平衡，平衡失調(diào)則導(dǎo)致急性排斥反應(yīng)或免疫耐受的發(fā)生。 目前針對(duì)肝移植急性免疫排斥反應(yīng)大多采用免疫抑制劑，但均不能完全抑制排斥并有諸多副作用。誘導(dǎo)外周免疫耐受減輕或阻止免疫排斥是一種較為理想的方法。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種多向分化潛能性與自我更新的細(xì)胞，具有獨(dú)特的免疫學(xué)與替代學(xué)特性。替代學(xué)

4、方面的研究認(rèn)為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外具有向肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞分化的能力，而免疫學(xué)方面的研究認(rèn)為MSC表達(dá)低水平的MHCII類(lèi)分子及Fas配體，不表達(dá)T細(xì)胞共刺激分子B7-1、B7-2、CD40、CD40L，免疫原性較弱，不激活異基因活化的T淋巴細(xì)胞，因此骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有免疫抑制作用，可能誘導(dǎo)免疫耐受。受體骨髓問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞源于受體自身，容易獲取、培養(yǎng)簡(jiǎn)單可反復(fù)采取，利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特性將受體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞輸注到移植肝內(nèi)

5、是否可以改善急性免疫排斥造成的損傷并可能抑制急性免疫排斥反應(yīng)?因此本課題首先建立DA→Lewis的原位肝移植急性免疫排斥模型，將Lewis來(lái)源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞輸注受體內(nèi)，觀測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)的分布、分化方向以及對(duì)肝內(nèi)細(xì)胞因子的影響，以證實(shí)受體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞輸注在肝移植術(shù)后的作用。 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容共分三部分： 第一章 大鼠同種異體原位肝移植模型的建立與病理學(xué)檢測(cè) 目的：采用DA→Lewis大鼠組合建立肝移植急性

6、免疫排斥模型，觀測(cè)肝組織急性免疫排斥病理表現(xiàn)。 方法：①取SD大鼠80只，雌雄不拘，采用改良二袖套法建立原位肝移植模型，術(shù)后不予任何免疫抑制劑，觀測(cè)術(shù)后生存狀態(tài)。 ②取DA與Lewis大鼠各9只，采用改良二袖套法建立原位肝移植急性免疫排斥模型，術(shù)后不予任何免疫抑制劑。觀察術(shù)后大鼠1d、7d、14d肝組織病理變化以及生存期。 結(jié)果：①原位肝移植模型SD→SD組合手術(shù)成功率為96％，術(shù)后長(zhǎng)期存活(2mon)達(dá)90％。

7、 ②SD→SD組合術(shù)后肝組織病理未見(jiàn)免疫排斥現(xiàn)象。 ③DA→Lewis組合可以產(chǎn)生典型的術(shù)后急性免疫排斥反應(yīng)。 ④術(shù)后大鼠生存期較短，約為12d-16d。 結(jié)論：①改良二袖套法可以建立穩(wěn)定的大鼠肝移植模型。 ②SD→SD組合非急性免疫排斥模型，術(shù)后可長(zhǎng)期存活。 ③DA→Lewis組合是觀測(cè)急性免疫排斥的典型組合。 ④術(shù)后如未予免疫抑制劑，Lewis大鼠生存時(shí)間短暫。 第二章

8、 受體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的獲取標(biāo)記與體內(nèi)示蹤 目的：探討大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與擴(kuò)增方法，研究標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，觀測(cè)標(biāo)記后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞輸注在大鼠肝移植體內(nèi)的短期與長(zhǎng)期分布。 方法：①取4周齡約100克Lewis大鼠10只，分離兩側(cè)股骨與脛骨用L-DMEM/F12培養(yǎng)基沖洗髓腔。分別用密度梯度離心法與裂紅法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)、擴(kuò)增骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。流式細(xì)胞儀鑒定第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表

9、面標(biāo)記及細(xì)胞周期。 ②采用CFSE標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，建模后經(jīng)門(mén)靜脈注入，于術(shù)后1d、7d、14d取肝移植模型肝、脾、肺、腎組織，熒光顯微鏡下觀測(cè)體內(nèi)分布情況，以正常Lewis大鼠為陽(yáng)性對(duì)照。 ③采用Brdu標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，建模后經(jīng)門(mén)靜脈注入，于術(shù)后14d、1mon、2mon取肝移植模型肝、脾、肺、腎組織，行免疫組織學(xué)染色，觀測(cè)體內(nèi)分布情況，以正常Lewis大鼠為陽(yáng)性對(duì)照。 結(jié)果：①原代培養(yǎng)24小時(shí)開(kāi)始貼

10、壁，10-14天時(shí)細(xì)胞貼滿瓶底。 ②P3代培養(yǎng)細(xì)胞表型測(cè)定CD29陽(yáng)性率95.3％，CD44陽(yáng)性率94.7％，CD34陰性率1.8％，CD45陰性率為0.8％。 ③P3代培養(yǎng)細(xì)胞GO/Gl期細(xì)胞約為82.9％，S+G2+M期的細(xì)胞為17.1％。 ④CFSE可快速高效的標(biāo)記MSCs，標(biāo)記率大于95％。 ⑤術(shù)后1d，7d，14d肝組織內(nèi)有大部分CFSE標(biāo)記的MSCs聚集，而脾肺腎組織中有CFSE標(biāo)記的MSCs

11、已經(jīng)開(kāi)始減少。 ⑥MSCs輸注正常Lewis大鼠體內(nèi)1d在肝脾肺腎組織中均有分布，5d后基本消失。 ⑦BrdU體外MSCs標(biāo)記率約為95％。 ⑧肝臟為Brdu陽(yáng)性細(xì)胞主要分布部位，脾肺腎組織僅有少量分布，術(shù)后14d、1mon、2mon肝內(nèi)Brdu陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)無(wú)明顯減少，但術(shù)后lmon脾肺腎組織中Brdu陽(yáng)性細(xì)胞消失。 ⑨正常Lewis大鼠體內(nèi)1dBrdu標(biāo)記MSCs偶見(jiàn)表達(dá)，在5d均為陰性表達(dá)。

12、結(jié)論：①采用紅細(xì)胞裂解方法較采用密度梯度離心方法獲取的MSCs更為簡(jiǎn)便。 ②通過(guò)密度梯度離心與紅細(xì)胞裂解后聯(lián)合貼壁培養(yǎng)法可獲取較為純化的MSCs。 ③CFSE是一種快速高效的細(xì)胞染色劑，受體MSCs輸注移植肝短期內(nèi)可特異性聚集于肝臟。 ④應(yīng)用BrdU標(biāo)記骨髓問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞是一種簡(jiǎn)單有效的標(biāo)記方式，受體MSCs輸注移植肝內(nèi)長(zhǎng)期分布仍以肝臟為主。 第三章 受體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞輸注對(duì)大鼠肝移植術(shù)后的影響

13、目的：觀測(cè)輸注受體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)大鼠原位肝移植的影響 方法：①取DA與Lewis大鼠各30只隨機(jī)分為3組，A組：僅行原位肝移植術(shù)，B組原位肝移植術(shù)+MSCs，C組：原位肝移植術(shù)+CsA，每組10對(duì)。觀測(cè)各組術(shù)后肝功能、比較生存時(shí)間差異。 ②于術(shù)后14d、1mon、2mon分別取各組肝組織標(biāo)本，免疫組化雙染色檢測(cè) Brdu抗體與ALB抗體、CK19抗體、vWF因子抗體的共表達(dá)。 ③于術(shù)后1d、7d、14d、lm

14、on分別取各組肝組織標(biāo)本，采用Luminex液相芯片平臺(tái)檢測(cè)IL-2，IL-4，IL-10，IFNγ等相關(guān)細(xì)胞因子在肝組織中的含量。 結(jié)果：①A組術(shù)后3d進(jìn)行性惡化，術(shù)后10-16d自然死亡。B、C組大鼠在術(shù)后14d后逐漸好轉(zhuǎn)，lmon后活動(dòng)增多體重逐漸增加。 ②各組肝組織病理學(xué)變化A組呈重度急性排斥反應(yīng)，B組呈輕度急性排斥反應(yīng)。C組呈中度急性排斥反應(yīng)。生存期比較B組、C組較A組生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P<0.05)，B組較C

15、組生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P<0.05)。 ③術(shù)后1mon、2mon肝組織內(nèi)有Brdu與ALB及Brdu與vwF因子的共表達(dá)，未見(jiàn)Brdu與CK19的共表達(dá)。 ④各細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-10，IFNY在術(shù)后1d、7d均有升高，但B組、C組低于A組(P<0.05)，術(shù)后14d、lmon B組細(xì)胞因子IL-4、IL-10濃度高于C組，B組細(xì)胞因子IL-2、IFNγ濃度低于C組。 結(jié)論：①輸注受體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞