骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植與粒細(xì)胞集落刺激因子干細(xì)胞動(dòng)員治療慢性心力衰竭的對(duì)比研究.pdf

1、近年來冠心病、急性心肌梗塞（AMI）發(fā)病率在我國呈逐漸升高的趨勢，盡管對(duì)心梗的治療方法取得很大進(jìn)步，但心梗后心室重構(gòu)，最終發(fā)展為慢性心力衰竭（CHF）仍是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[1]。心肌細(xì)胞損傷壞死后由膠原、纖維結(jié)締組織替代，壞死部位變薄延展導(dǎo)致心衰。隨著藥物治療、介入技術(shù)和外科治療水平的提高，心肌梗塞患者心功能不全的病程得到延緩，但在成功接受血運(yùn)重建的心肌梗死患者中，仍有超過30％患者發(fā)生遠(yuǎn)期左室重構(gòu)，引發(fā)心力衰竭。慢性心衰患者預(yù)后不

2、良，因此對(duì)再生壞死心肌、提高患者生存率的研究已成為刻不容緩的任務(wù)。 大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，骨髓干細(xì)胞可以取代壞死的心肌細(xì)胞并建立新的血管來改善缺血心肌供血，從而明顯改善心功能，臨床研究較多的有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMMScs）移植[2]，以及采用粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF）進(jìn)行骨髓干細(xì)胞動(dòng)員

3、[3]兩種方法。 骨髓干細(xì)胞是未分化的前體細(xì)胞，可以分化為多種細(xì)胞，包括心肌細(xì)胞，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，BMMSCs自體移植通過修復(fù)壞死心肌達(dá)到改善心臟功能的目的[4，5]。 目前研究表明，G-CSF能動(dòng)員骨髓干細(xì)胞遷移至梗死部位，參與壞死心肌修復(fù)[6，7]。Orlic等[8]對(duì)大鼠的研究表明，G-CSF動(dòng)員的骨髓干細(xì)胞除能分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞外，還能分化為心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞。但Norol等[9]對(duì)狒狒心梗后使用G-CSF治

4、療，只是在梗死區(qū)發(fā)現(xiàn)有內(nèi)皮細(xì)胞，沒有發(fā)現(xiàn)新分化的心肌細(xì)胞。另外，G-CSF能增加梗死區(qū)巨噬細(xì)胞浸潤，加速壞死組織的吸收，減少肉芽組織和瘢痕的形成，從而促進(jìn)梗死區(qū)的愈合過程[10]。 可以認(rèn)為G-CSF骨髓干細(xì)胞動(dòng)員與BMMSCs移植治療心肌梗死，其有效的細(xì)胞成份基本相同，然而目前國內(nèi)外尚未有對(duì)這兩種方法治療心肌梗死后慢性心衰的效果進(jìn)行比較的報(bào)道。本研究目的在于觀察BMMSCs移植治療心肌梗死后慢性心力衰竭療效的同時(shí)，研究其可能機(jī)

5、制，并對(duì)BMMSCs移植和G-CSF骨髓干細(xì)胞動(dòng)員這兩種方法進(jìn)行比較，從而探討更有效、更適合的干細(xì)胞治療心肌梗死后慢性心力衰竭的方法。 本研究分三部分：第一部分大鼠心肌梗死后慢性心力衰竭模型的制作；第二部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、擴(kuò)增和純化；第三部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植與干細(xì)胞動(dòng)員治療慢性心衰模型的對(duì)比研究。 第一部分大鼠心肌梗死后慢性心力衰竭模型的制作 目的:為研究干細(xì)胞移植在治療心衰中的價(jià)值，本研究目的在

6、于建立大鼠心肌梗死后心力衰竭模型，完善制作方法，并進(jìn)行評(píng)估，深入心衰機(jī)制的研究。 方法:Wistar大鼠在左冠狀動(dòng)脈前降支（LAD）起始部2～3mm處結(jié)扎，造成左心室大面積心肌梗死，建立心梗后慢性心力衰竭模型。觀察術(shù)后大鼠表現(xiàn)、心電圖變化。在模型建立前和建立后8周進(jìn)行連續(xù)超聲檢查，超聲心動(dòng)圖檢查儀使用SONOS7500型超聲診斷儀，心臟探頭頻率為10MHz。用二維切面超聲，選取大鼠左室長軸、短軸和心尖四腔心切面結(jié)合M型多普勒超聲

7、進(jìn)行檢查，測量左室收縮末內(nèi)徑（LVDs）、左室舒張末內(nèi)徑（LVDd）、左室收縮末前壁厚度（LVATs）、左室舒張末前壁厚度（LVATd）、收縮末室間隔厚度（IVSTs）、舒張末室間隔厚度（IVSTd）、短軸縮短率（FS）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）等指標(biāo)，連續(xù)測量3次取均值；進(jìn)行血流動(dòng)力學(xué)檢查，檢測心率（HR）、左室收縮壓（LVSP）、左室舒張術(shù)壓（LVEDP）、計(jì)算左室壓力最大上升速率（+dp/dtmax）和左室壓力最大下降速率（-dp

8、/dtmax），并與術(shù)前和同期的對(duì)照組比較。術(shù)后8周處死，對(duì)心臟進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，判斷心梗區(qū)域大小。 結(jié)論:心梗后8周形成心衰模型，通過術(shù)中術(shù)后采取必要的措施，可以提高動(dòng)物生存率。此方法有效且重復(fù)性好，可較理想地模擬心梗后慢性充血性心力衰竭的發(fā)生，對(duì)研究探討慢性心衰機(jī)制有重要意義。 第二部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、擴(kuò)增和純化 目的建立一種簡便、快速、實(shí)用的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMMSCs）體外分離、純化和

9、擴(kuò)增的方法，觀察其生長狀況、形態(tài)學(xué)特征和生物學(xué)特性，為慢性心力衰竭模型進(jìn)行干細(xì)胞移植提供種子細(xì)胞。 方法采用密度梯度離心法對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取、分離、培養(yǎng)和體外擴(kuò)增，用離心的方法分離出大白鼠的股骨骨髓，淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)沖洗后，培養(yǎng)、傳代，得到第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（P3），于培養(yǎng)液中加入終濃度為50ug/ml的4，6二乙?；?2-苯基吲哚（DAPI），孵育，然后用Hanks平衡鹽液洗去未結(jié)合的DAPI。利

10、用熒光顯微鏡觀察計(jì)數(shù)同一個(gè)視野胞核發(fā)出藍(lán)色熒光的細(xì)胞數(shù)目，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野取其平均值，計(jì)算二者的比值即得到DAPI的標(biāo)記率。 結(jié)論:經(jīng)密度梯度離心法得到的骨髓干細(xì)胞內(nèi)含有較多的BMMSCs，利用貼壁培養(yǎng)傳代方法成功對(duì)BMMSCs進(jìn)行分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和純化，細(xì)胞活力好。增殖能力強(qiáng)。DAPI標(biāo)記BMMSCs敏感性好，標(biāo)記效率高，可作為標(biāo)記細(xì)胞的一種有效手段，BMMSCs體外培養(yǎng)成功為治療慢性心力衰竭提供了種子細(xì)胞。

11、 第三部分 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植與干細(xì)胞動(dòng)員治療慢性心衰模型的對(duì)比研究 目的:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植與粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）動(dòng)員自體骨髓來源的干細(xì)胞對(duì)大鼠心梗后慢性心力衰竭的治療作用進(jìn)行比較，探討更有效、更適用的干細(xì)胞治療心梗后慢性心衰的方法。 方法:建立Wistar大鼠左冠狀動(dòng)脈結(jié)扎方法復(fù)制心肌梗死后心衰模型，隨機(jī)分為干細(xì)胞移植組、干細(xì)胞動(dòng)員組和對(duì)照組。移植組（n=10）模型建立后再次開胸，于梗死區(qū)

12、內(nèi)注射經(jīng)4，6-二乙酰基-2-苯基吲哚（DAPI）標(biāo)記后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，將細(xì)胞移植至梗死區(qū)。動(dòng)員組（n=10）模型建立后開始皮下注射粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）30μg/kg·d，連續(xù)使用5天，對(duì)照組（n=10）不采取任何治療措施。4周后采用超聲心動(dòng)圖檢查心臟功能變化，用多道生理記錄儀做血液動(dòng)力學(xué)測定，描記左室收縮壓（LVSP）、左室舒張末壓（LVEDP）、左室等容收縮/舒張期壓力上升或下降最大速率（±LVdp/dtmax）以反