川芎嗪對PDGF誘導(dǎo)大鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖的抑制作用及分子機(jī)制.pdf

1、目的：氣道平滑肌細(xì)胞異常增殖是哮喘氣道重塑的重要病理特征。研究氣道平滑肌細(xì)胞的增殖機(jī)理對支氣管哮喘及氣道重塑的逆轉(zhuǎn)和預(yù)防有著重要意義。川芎嗪是從傳統(tǒng)中藥川芎的干燥根莖提取的一種活性生物堿單體。目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床呼吸道疾病，特別是哮喘的治療。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠原代ASMC的增殖模型，觀察川芎嗪對ASMC增殖的影響。從細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)水平研究川芎嗪治療哮喘的作用機(jī)制，并探討其可能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及藥物作用靶點(diǎn)。為臨床應(yīng)用川芎嗪治療哮喘提

2、供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1．采用酶消化聯(lián)合組織塊貼壁法培養(yǎng)原代大鼠氣道平滑肌細(xì)胞。 2．建立增殖模型：采用PDGF誘導(dǎo)ASMC增殖。MTT法檢測A490的吸光度值，以觀察PDGF誘導(dǎo)ASMC增殖作用以及川芎嗪對PDGF誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖的抑制作用。 3．流式細(xì)胞儀分析ASMC經(jīng)PI染色DNA含量以觀察細(xì)胞周期。 4．Western Blotting檢測ERK1/2及p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平。

3、 5．Hoechst33342染色檢測細(xì)胞凋亡。 結(jié)果： 1．改進(jìn)的培養(yǎng)方法成功培養(yǎng)出可傳代的原代大鼠ASMC。 2．隨著PDGF濃度的升高（2～80 ng/ml），MTT比色法A490值呈上升趨勢。與對照組相比較，20 ng/ml和80 ng/ml PDGF-BB組有統(tǒng)計學(xué)意義。相同濃度PDGF-BB各時間點(diǎn)相比較，20 ng/ml和80 ng/ml、組有統(tǒng)計學(xué)意義。 3．川芎嗪作用12h后50μmol

4、/L、100μmol/L和200μmol/L組抑制率較對照組（PDGF刺激組）顯著升高；與對照組相比48h后各濃度組抑制率均升高。 4．川芎嗪處理24h后，與對照組比較，50μmol/L、100μmo/L和200μmol/L組的ASMC G0/G1期比率明顯增加，S期細(xì)胞比率降低，且CV<8。 5．川芎嗪與PDGF（20 ng/ml）共同處理30min和60 min后p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平顯著降低。 6．H

5、oechst33342觀察到50μmol/L、200μmol/L和400μmol/L川芎嗪組中強(qiáng)熒光細(xì)胞比例隨川芎嗪劑量增大而增多，川芎嗪處理的細(xì)胞出現(xiàn)了核內(nèi)多個不均一藍(lán)染現(xiàn)象。 結(jié)論： 1．應(yīng)用改良組織塊消化法，培養(yǎng)和建立了原代大鼠ASMC。 2．應(yīng)用PDGF-BB成功誘導(dǎo)ASMC增殖，建立細(xì)胞增殖模型。 3．TMP可抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的ASMC增殖，使細(xì)胞周期停滯于G0/G1期。并存在濃度依賴關(guān)系