三氯化釓對大鼠移植肝缺血再灌注損傷保護(hù)作用的研究.pdf

1、第一部分三氯化釓對肝臟枯否細(xì)胞活性的影響。 目的：研究三氯化釓對枯否細(xì)胞的活性及細(xì)胞因子釋放的影響并闡明機(jī)制。 方法：采用膠原酶原位灌注法分離及提純枯否細(xì)胞。將細(xì)胞分為4組：A組為對照組，培養(yǎng)正常大鼠KCs；B組為LPS刺激組，在開始培養(yǎng)KCs時，培養(yǎng)液中加入終濃度為10mg/l LPS；C組為LPS+GdCl3組，在培養(yǎng)液中先加入2mmol/l GdCl3培養(yǎng)24h，然后再加入10mg/l LPS。各組分別于培養(yǎng)6h后

2、獲取標(biāo)本作相應(yīng)指標(biāo)檢測，重復(fù)8次實(shí)驗(yàn)后取均值（n=8）。將各組細(xì)胞置于倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)變化，碳粒吞噬實(shí)驗(yàn)檢測各組枯否細(xì)胞吞噬活性，抗ED-2免疫組化染色檢測純度，ELISA法檢測細(xì)胞上清液中IL-1和TNF-α水平。 結(jié)果：新分離的KCs在倒置顯微鏡下呈球形，懸浮于培養(yǎng)基中；約6h后，大部分細(xì)胞貼壁呈扁圓形，少數(shù)細(xì)胞伸出偽足；24h后大部分細(xì)胞伸出偽足，約48h后所有細(xì)胞已完全展開，呈典型星形和多角形，細(xì)胞體積明顯變大；細(xì)

3、胞爬片HE染色，KCs呈典型星狀，胞核呈腎形；各組枯否細(xì)胞分離純度均為90％，活性>96％。吞噬能力檢測與B組比較，C組細(xì)胞內(nèi)的碳粒密度明顯低于前者，細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯改變；與A組比較，B組IL-1和TNF-α水平明顯增高（P<0.05）；與B組比較，C組IL-1和TNF-α明顯較低（P<0.05）。 結(jié)論： （1）采用膠原酶原位灌注法分離及提純的肝臟枯否細(xì)胞純度可達(dá)90％，活性大于96％，符合實(shí)驗(yàn)要求； （2）

4、GdCl3能抑制枯否細(xì)胞吞噬活性，從而減少枯否細(xì)胞激活后釋放TNF-α及IL-1。 第二部分大鼠原位肝移植缺血再灌注模型的建立。 目的：建立穩(wěn)定的大鼠原位肝移植缺血再灌注模型，為研究肝移植缺血再灌注提供理想的動物模型。 方法：采用改良Kamada's“兩袖套法”建立大鼠肝移植模型。模型的建立均采用封閉群雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，受體略大于供體。術(shù)后飼喂10％葡萄糖水，前3d肌注10萬U青霉素，術(shù)

5、后均不使用免疫抑制劑。 結(jié)果：100例定型手術(shù)中，供肝獲取時間為45-60min，熱缺血時間0-0.5min，供肝修整時間為12-15min，供肝冷缺血時間120min，無肝期平均為18～22min，24h存活率為92.0％（92/100）。手術(shù)失敗或24h內(nèi)死亡8例：麻醉意外3例，術(shù)中大失血4例，膈肌破裂導(dǎo)致氣胸1例；1d-7d內(nèi)死亡9例：感染4例，膽漏3例，原因不明2例。 結(jié)論： （1）盡量縮短手術(shù)時間和無肝

6、期以及熟練的顯微外科操作技術(shù)是手術(shù)成功的關(guān)鍵。 （2）采用改良Kamada's“二袖套法”建立大鼠原位肝移植模型穩(wěn)定可靠，為后繼實(shí)驗(yàn)研究提供基礎(chǔ)。 第三部分三氯化釓對移植肝缺血再灌注的保護(hù)作用的研究。 目的：探討三氯化釓對大鼠移植肝缺血再灌注損傷的影響及其機(jī)制。 方法：供、受體均采用雄性SD，將實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為3組，n=8：假手術(shù)組（A組）；生理鹽水預(yù)處理組（B組）；三氯化釓預(yù)處理組（C組）。采用改良Ka

7、mada's“兩袖套法”建立大鼠肝移植模型，24h后處死大鼠檢測ALT、AST、AKP、γ-GT；肝組織HE染色后置光鏡下觀察病理形態(tài)學(xué)變化，并根據(jù)Suzuki's評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行半定量評分；TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡并計(jì)算凋亡指數(shù)；ELISA檢測法測定肝組織的TNF-α，IL-1水平。 結(jié)果： C組、B組與A組比較，各組血清ALT、AST、AKP、γ-GT水平明顯升高（P<0.05）；病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)B組、C組病變范圍及IRI程度

8、均較A組明顯增加。而C組與B組比較，血清ALT、AST、AKP、γ-GT水平有所減輕（P<0.05）；與B組比較，C組血清IL-1、TNF-α及AI明顯降低（P<0.05）；與B組比較，C組淤血、空泡變性及壞死Suzuki's評分均較低（P<0.05）。 結(jié)論： （1）三氯化釓能抑制枯否細(xì)胞釋放細(xì)胞因子； （2）三氯化釓對移植肝缺血再灌注損傷有保護(hù)作用； （3）三氯化釓對移植肝缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制一定