LPK基因在非酒精性脂肪肝中的表觀遺傳學研究.pdf

1、非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)嚴重危害人類健康。丙酮酸激酶基因(L-type pyruvate kinase，LPK)是糖酵解通路中的關鍵基因之一，多個關聯(lián)研究結果都顯示LPK基因和非酒精性脂肪肝的發(fā)生有顯著相關性，為此，我們在NAFLD模型中開展了LPK基因表觀遺傳學研究。
　　首先，通過棕櫚酸(palmitic acid，PA)誘導大鼠肝臟細胞(BRL)制備了N

2、AFLD細胞模型，通過高脂飲食喂養(yǎng)SD大鼠建立了NAFLD大鼠模型。在兩種NAFLD模型中LPK基因的mRNA和酶活性都顯著下降(P＜0.01)，LPK蛋白表達量在BRL細胞模型中也有明顯下調(diào)。在人肝細胞(QSG7701)中過量表達LPK基因，可顯著提高細胞增殖速率(P＜0.05)、加快葡萄糖消耗速度(P＜0.01)、增強細胞甘油三酯代謝速率(P＜0.01);抑制LPK基因表達后，上述指標均顯著下降，顯示LPK基因對于細胞增殖、糖脂代謝

3、具有重要的調(diào)控作用。鹽酸小檗堿(Breberine，BBR)對NAFLD細胞和動物模型進行干預后，均可以顯著提高LPK基因的表達和酶活性(P＜0.01)。
　　在此基礎上，該論文從DNA甲基化，組蛋白乙酰化和miRNA調(diào)控三方面研究NAFLD模型中表觀遺傳學修飾對LPK基因表達的影響:
　　1.NAFLD大鼠和細胞模型中LPK基因啟動子區(qū)域CpG位點的甲基化程度顯著高于正常對照組(P＜0.05)。熒光素酶(Luc)報告系統(tǒng)表

4、明LPK基因啟動子區(qū)域甲基化程度升高會顯著降低(P＜0.01)LPK基因啟動子活性。高效液相色譜(HPLC)實驗顯示:兩種NAFLD模型的基因組DNA整體甲基化水平均顯著降低(P＜0.01)。定量PCR結果顯示DNA甲基轉移酶Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b的mRNA表達量在兩種NAFLD模型中均顯著降低(P＜0.05)。BBR藥物干預可以顯著降低(P＜0.05)LPK基因啟動子區(qū)域各CpG位點的甲基化程度;提高部分DNA甲基轉移

5、酶Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b的mRNA表達量，從而升高基因組DNA的整體甲基化水平(P＜0.05)。
　　2.染色質免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation，ChiP)實驗發(fā)現(xiàn)兩種NAFLD模型中LPK基因DNA區(qū)域組蛋白H3、H4的總體乙?；潭染@著低于對照組(P＜0.01)。BBR藥物干預可以選擇性降低LPK基因DNA區(qū)域組蛋白H3、H4的總體乙?；潭?P＜0.05)。NAFLD大鼠

6、模型中LPK轉錄調(diào)控因子ChREBP與LPK啟動子區(qū)域的結合量減少(P＜0.01)。
　　3.microRNA.org網(wǎng)站預測LPK3'-UTR區(qū)域存在miR-15b作用序列。定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，miR-15b表達量在NAFLD細胞和動物模型中都顯著升高(P＜0.01)。在QSG7701細胞中轉染miR-15b會顯著降低LPK的mRNA表達量(P＜0.01)、降低細胞增殖速率(P＜0.01)、減少葡萄糖消耗量(P＜0.05)，減慢

7、甘油三酯的代謝速度(P＜0.05)。Luc報告系統(tǒng)顯示miR-15b可以顯著降LPK3'-UTR的活性，說明miRNA-15b能夠抑制LPK酶的表達。此外，在我們收集的37例健康人和64例脂肪肝患者的血清的miRNA定量檢測中，發(fā)現(xiàn)脂肪肝患者血清中miR-15b的表達量顯著高于(P＜0.01)健康人。這提示miR-15b可能是潛在的血清標志物
　　綜上所述，本課題從表觀遺傳學的三個方面:DNA甲基化、組蛋白乙?；蚼iRNA調(diào)控初