淋巴細胞活化與BMMSCs向脂肪分化的相互影響及可能的臨床意義.pdf

1、淋巴細胞活化與BMMSCs向脂肪分化的相互影響及可能的臨床意義研究背景再生障礙性貧血(再障,AplasticAnemia,AA)發(fā)病機理較為復(fù)雜,近來認識到免疫機制紊亂尤其是淋巴細胞免疫功能紊亂在再障發(fā)病中的作用,己成為再障基礎(chǔ)研究方面一個最活躍的領(lǐng)域。骨髓間充質(zhì)干細胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells,BMMSCs)作為骨髓基質(zhì)細胞的起源細胞細胞,BMMSCs及其分化成的細胞在再障發(fā)病過程中的作用鮮有研究報

2、道。紅髓脂肪化是再障特征性病理改變。但對于再障骨髓中的脂肪組織增多原因及作用尚未見到相關(guān)報道。一直以來,脂肪組織被認為是單純的能量儲存組織。然而隨著一些脂肪細胞分泌的因子被人們發(fā)現(xiàn),脂肪細胞的其他重要生理學功能被逐漸發(fā)掘出來。數(shù)十種脂肪細胞分泌因子(adipocyte-secretedfactors)在近10余年來已被相繼發(fā)現(xiàn),并引起廣泛重視。這些因子被統(tǒng)稱為脂肪細胞因子(adipocytokines)或簡稱脂肪因子(adipokine

3、s)。目前認為脂肪組織是有獨特組織類型,具有特定功能(例如,平衡能量儲備、分泌激素和調(diào)節(jié)免疫)的真正器官系統(tǒng)。Leptin和Adiponectin是脂肪組織參與免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)的兩個主要的脂肪因子。Leptin對T淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞都具有免疫調(diào)節(jié)作用。免疫細胞受到免疫刺激后,產(chǎn)生細胞因子(尤其是TNF-α)作用于脂肪細胞,使其分泌Leptin,從而達到使免疫信號擴大化的目的。Adiponectin是脂肪細胞表達最豐的激素。主要在天

4、然免疫效應(yīng)中發(fā)揮作用,能抑制髓單核細胞祖細胞的增殖,抑制巨噬細胞的活性。因此,與Adiponectin不同,對于造血免疫系統(tǒng),Adiponectin被看作是一種負調(diào)控因素,可能參與炎癥反應(yīng)的終止。異常的免疫反應(yīng)可能在損傷造血干細胞的同時對BMMSCs也具有損傷作用,對BMMSCs的脂肪分化能力產(chǎn)生一定的影響,骨髓內(nèi)顯著增多的脂肪細胞也可能對免疫系統(tǒng)有一定的作用。我們對此進行以下研究,以期從一個新的角度探索再生障礙性貧血的發(fā)病機制。目的(

5、1)體外分離、培養(yǎng)、擴增小鼠BMMSCs,并研究其生物學特點。(2)培養(yǎng)、擴增再障患者和正常對照BMMSCs,比較兩組BMMSCs生物學特性及脂肪分化能力的不同。(3)建立免疫相關(guān)骨髓衰竭動物模型,觀察免疫紊亂條件下模型小鼠骨髓脂肪化程度的改變,并研究該模型BMMSCs的生物學特性。(4)研究同基因條件下,活化淋巴細胞對BMMSCs向脂肪分化能力的影響及BMMSCs向脂肪細胞分化后對單個核細胞(MNCs)增殖及活化狀態(tài)的影響。方法(1)

6、貼壁篩選法分離純化BALB/c小鼠BMMSCs,胰酶消化傳代,FCM鑒定細胞表型,并在特定誘導劑下誘導向脂肪細胞、成骨細胞及軟骨細胞分化。(2)體外密度梯度離心法分離培養(yǎng)正常人和再障患者的BMMSCs,觀察其形態(tài)學的異同,同時用流式細胞儀檢測其分子表面抗原以及RT-PCR法檢測成脂肪細胞的差異。(3)C57BL/6小鼠(父本)和BALB/c小鼠(母本)雜交產(chǎn)生CByB6F1小鼠,將F1小鼠γ射線亞致死量照射(4.5Gy)后尾靜脈注射母本

7、淋巴細胞,建立免疫相關(guān)骨髓衰竭動物模型。記錄白細胞,紅細胞,血小板及血紅蛋白的變化,股骨切片HE染色觀察模型小鼠骨髓脂肪化程度,貼壁篩選法分離小鼠BMMSCs,觀察其生物學特性的改變。(4)將Percoll密度梯分離BALB/c小鼠脾臟MNCs,ConA活化后與BALB/c小鼠BMMSCs共培養(yǎng)72小時,Real-timePCR,WesternBlot及ELISA檢測BMMSCs脂肪分化相關(guān)基因和蛋白表達的變化。BMMSCs誘導分化成脂

8、肪細胞,與脾MNCs共培養(yǎng)72小時,CCK-8檢測MNCs增殖,流式檢測淋巴細胞活化標志的變化。結(jié)果(1)BMMSCs呈梭形或三角形,長梭形,細胞排列整齊,低倍鏡下部分呈平行狀或旋渦狀。流式檢測BMMSCs高表達CD44,CD73,CD90和CD105,低表達或不表達CD14,CD34,CD45及HLA-DR。在特定的誘導條件下,BMMSCs能向脂肪細胞,成骨細胞及軟骨細胞分化。(2)在起始培養(yǎng)細胞數(shù)相同條件下,初次換液時再障患者形成的

9、克隆數(shù)明顯少于正常對照[(19.3±4.77)/5×10 5MNCsvs(47.72±3.46)/5×10 5MNCs,(P<0.05)],再障組和正常對照BMMSCs細胞形態(tài)和表面標志無明顯差別,體外再障患者BMMSCs向脂肪細胞誘導分化較正常組早。(3)CByB6F1小鼠亞致死量照射后,骨髓衰竭為可逆性,外周血象在第10天開始恢復(fù),約6周恢復(fù)至正常水平,而亞致死量照射后經(jīng)尾靜脈注射母本小鼠淋巴細胞的小鼠,外周血象降低為不可逆性,造成

10、不可逆性免疫相關(guān)骨髓衰竭。骨髓病理學檢查證實骨髓衰竭,免疫相關(guān)骨髓衰竭組小鼠髓腔空虛,脂肪組織明顯增多,而正常對照組和單獨照射組骨髓內(nèi)均無明顯脂肪組織形成。體外培養(yǎng)證實,與對照組相比,免疫相關(guān)骨髓衰竭組小鼠BMMSCs增殖能力降低,不能傳代。(4)體外培養(yǎng),BALB/c小鼠BMMSCs與經(jīng)ConA活化的BALB/c小鼠脾臟的MNCs按1:5比例共培養(yǎng)72小時,Real-timePCR檢測發(fā)現(xiàn),BMMSCs的Leptin基因表達明顯增加而

11、Adiponectin基因表達輕度降低,WesternBlot檢測該兩種蛋白表達也有近似的趨勢。ELISA定量檢測共培養(yǎng)上清中這兩種蛋白的表達發(fā)現(xiàn),Leptin低于檢測下限而Adiponectin則明顯減少。將BALB/c小鼠的脾MNCs與其BMMSCs或脂肪分化的BMMSCs按一定比例共培養(yǎng),BMMSCs:MNCs為1:0.5時,脂肪分化的BMMSCs組的淋巴細胞增殖抑制作用顯著低于正常對照組BMMSCs[正常對照組vs脂肪分化組為-

12、(77.8±20.7)％vs-(47.8±14.3)%,(P<0.05)];而其比例相當(BMMSCs:淋巴細胞為1:1)時,脂肪分化的BMMSCs組對淋巴細胞的作用為輕度促增殖,但與正常對照組的輕度抑制增殖作用相比,差異無顯著性[正常對照組vs脂肪分化組為-(28.3±5.2)%vs(3.3±4.9)%,(P>005)];當淋巴細胞數(shù)量逐漸增多,超過BMMSCs數(shù)量時,脂肪化的BMMSCs組就表現(xiàn)為促淋巴細胞增殖作用[正常對照組vs脂

13、肪分化組為1:2.5時(-3.9±8.3)%vs(34.2±17.1)%,(P<0.05);1:5時(9.4±8.8)%vs(40.8±16.3)%(P<0.05);1:10時(20±14.9)%vs(65.8±12.5)%(P<0.05)],而且該作用在一定比例范圍內(nèi),隨著淋巴細胞數(shù)量的增多而逐漸增強。脂肪分化的BMMSCs與MNCs共培養(yǎng)72h后,卻能使淋巴細胞的活化標志CD25和CD69表達與正常對照組相比明顯增增加[脂肪分化BM

14、MSCs共培養(yǎng)組vs正常BMMSCs共培養(yǎng)組:CD25+(50.9±7.7)%vs(16.2±5.7)%,(P<0.05);CD69+(47.3±5.8)%vs(13.3±4.6)%(P<0.05)]。結(jié)論(1)全骨髓貼壁篩選培養(yǎng)法可簡便、高效分離、純化BMMSCs。所獲得的細胞具有BMMSCs特征性的細胞表型及向脂肪細胞、成骨細胞及軟骨細胞分化能力。(2)再障患者BMMSCs形態(tài)與正常對照相比無明顯變化,但其增殖能力較正常對照降低,而

15、且脂肪細胞分化早于正常對照。(3)CByB6F1小鼠在亞致死量照射后,骨髓衰竭為可逆性,經(jīng)尾靜脈注射母本小鼠淋巴細胞可誘導不可逆性骨髓衰竭,形成免疫相關(guān)骨髓衰竭動物模型,模型動物骨髓脂肪組織明顯增多,BMMSCs增殖能力降低,不能傳代,對照組卻無此種改變。(4)ConA活化的淋巴細胞能促進BMMSCs脂肪分化相關(guān)基因的表達,且脂肪因子分泌失調(diào),Leptin增加而Adiponectin減少。當BMMSCs誘導分化為脂肪細胞后,與MNCs共