前列腺癌血清miRNAs表達(dá)譜的檢測(cè)和miR-101靶向EZH2調(diào)控作用的初步研究.pdf

1、前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性最常見的泌尿系惡性腫瘤之一。目前主要的治療方法有：根治性手術(shù)治療和內(nèi)分泌治療、放射治療及化療等。根治術(shù)后局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及許多無(wú)手術(shù)機(jī)會(huì)的患者，常選用內(nèi)分泌治療。接受內(nèi)分泌治療的患者，大多數(shù)起初有效，但幾乎都將逐漸發(fā)展為激素非依賴性前列腺癌或激素難治性前列腺癌，激素治療將不再有效。因此，揭示前列腺癌進(jìn)展中的分子機(jī)制已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。微小RNA（microRNA，miRNA，

2、miR）是一類長(zhǎng)度約21～25nt的非編碼RNA，它通過(guò)影響mRNA的翻譯和穩(wěn)定性，在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮靶基因內(nèi)源性抑制因子的作用。在過(guò)去的幾年中，各種人類腫瘤的miRNA表達(dá)譜分析提示許多miRNA發(fā)揮著抑癌基因的作用。相對(duì)于正常組織而言，miR-101在多種惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)，目前認(rèn)為miR-101可能作為一個(gè)惡性腫瘤治療性干預(yù)的潛在靶點(diǎn)。
　　本研究中我們首先檢測(cè)不同臨床階段前列腺癌患者的血清和前列腺增生患者的血清中差異性的mi

3、RNAs表達(dá)譜，篩選與前列腺癌相關(guān)的miRNA。探索血清中miR-101能否有利于前列腺癌的診斷和評(píng)估其惡性程度。此外，我們利用人工合成的miR-101模擬物（miR-101 mimics）轉(zhuǎn)染前列腺癌PC-3細(xì)胞，從而分析在前列腺癌中miR-101與EZH2的靶向調(diào)節(jié)效應(yīng)和作用機(jī)制。
　　本研究分兩個(gè)部分：
　　第一部分，前列腺癌患者血清miRNAs表達(dá)譜的研究
　　目的：研究不同臨床階段前列腺癌患者的血清和前列腺增

4、生患者的血清中差異性表達(dá)的miRNAs譜，篩選與前列腺癌相關(guān)的miRNA。
　　方法：采用 miRNA芯片技術(shù)(miRNA microarray)篩選激素依賴性前列腺癌（androgen-dependent prostate cancer, ADPC）、激素非依賴性前列腺癌（androgen-independent prostate cancer, AIPC）和前列腺增生（benign prostatic hyperplasia,

5、 BPH）患者血清中差異表達(dá)的miRNA，并對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取的表達(dá)差異的miRNA所調(diào)控的靶基因功能進(jìn)行GO分析和pathway分析。
　　結(jié)果：對(duì)3例ADPC、3例AIPC和3例前列腺增生患者的血清進(jìn)行了miRNA芯片分析，共篩選出31個(gè)差異表達(dá)的miRNA；ADPC組與BPH組血清相比，有8個(gè)miRNA表達(dá)存在差異，其中有7個(gè) miRNA表達(dá)上調(diào)（miR-181a-2、miR-29a、miR-423-5p、miR-424、miR

6、-1184、miR-671-3p、miR-548b-3p），1個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)（let-7b）（P<0.001）；AIPC組與 BPH組血清相比，有9個(gè) miRNA表達(dá)上調(diào)（miR-181a-2、miR-3664、miR-519e、miR-144、miR-603、miR-187、miR-491-3p、miR-BART20-5p、miR-3139），有6個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)（miRPlus-A1073、miR-542-3p、miR-6

7、60、miR-134、miR-15b、miR-H4-3p）（P<0.001）；其中 miR-181a-2在 ADPC組和AIPC組中均明顯高表達(dá)；AIPC組與 ADPC組血清相比，分別有4個(gè) miRNA表達(dá)上調(diào)和下調(diào)，其中上調(diào)的 miRNA為 miR-BART16、miR-3142、miR-491-3p、miR-214；下調(diào)的miRNA為miR-369-3p、miR-371-3p、miR-495、miR-671-3p（P<0.001）。

8、通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)分析得出異常表達(dá)miRNA調(diào)控的靶基因并進(jìn)行Gene Ontology（GO）和Pathway的顯著性分析，得到了相應(yīng)的顯著性的GOs和和Pathway。
　　結(jié)論：miRNA可能參與了前列腺癌的發(fā)生發(fā)展和雄激素非依賴性的轉(zhuǎn)變，血清中差異性表達(dá)的 miRNA可能成為潛在的前列腺癌診斷和治療的靶點(diǎn)，其中miR-181a-2可能與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。前列腺癌血清中未能檢測(cè)到 miR-101的差異表達(dá)，這證實(shí)血清和組織中m

9、iRNA的相關(guān)性仍存在爭(zhēng)議。
　　第二部分，miR-101和EZH2在前列腺癌中的表達(dá)以及miR-101靶向EZH2對(duì)PC3細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　目的：通過(guò)檢測(cè)前列腺癌及正常前列腺上皮細(xì)胞中 miR-101和 EZH2的表達(dá)水平，利用合成的miR-101 mimics轉(zhuǎn)染前列腺癌PC-3細(xì)胞并觀察對(duì)其生物學(xué)行為的影響，從而分析在前列腺癌中miR-101與EZH2的靶向調(diào)節(jié)效應(yīng)和作用機(jī)制。
　　方法：運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PC

10、R（Real-time quantitative PCR）檢測(cè)前列腺癌PC-3細(xì)胞、LNCaP細(xì)胞和前列腺正常上皮RWPE-1細(xì)胞中miR-101和EZH2 mRNA的表達(dá)；應(yīng)用Western-Blot蛋白印記法檢測(cè)上述細(xì)胞中EZH2的蛋白表達(dá)水平；PC-3細(xì)胞分為三組：不轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照組（B組）；轉(zhuǎn)染NC的陰性對(duì)照組（NC組）；轉(zhuǎn)染miR-101 mimics的實(shí)驗(yàn)組（miR-101組）。通過(guò)miR-101mimics轉(zhuǎn)染前列腺癌PC

11、-3細(xì)胞并上調(diào)細(xì)胞中miR-101的表達(dá)，Real-time qPCR和Western blot檢測(cè)細(xì)胞中EZH2表達(dá)水平的變化；應(yīng)用噻唑藍(lán)比色法（MTT法）測(cè)定細(xì)胞增殖情況、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期；Annexin V/PI雙染色法測(cè)量細(xì)胞凋亡率；劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲力。對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：（1）miR-101在PC-3細(xì)胞和LNCaP細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于RWPE-1細(xì)

12、胞，miR-101在前列腺各細(xì)胞株間的表達(dá)具有顯著差異性（P<0.05）。（2） EZH2 mRNA在PC-3細(xì)胞和LNCaP細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于RWPE-1細(xì)胞，EZH2蛋白在PC-3細(xì)胞和LNCaP細(xì)胞中的表達(dá)也明顯高于RWPE-1細(xì)胞，EZH2mRNA和蛋白在前列腺各細(xì)胞株間的表達(dá)具有顯著差異性（P均<0.05）。miR-101的表達(dá)量與EZH2表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)（P<0.05）。（3）miR-101 mimics轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞

13、后，細(xì)胞中的miR-101表達(dá)上調(diào)（P<0.05），而EZH2 mRNA和蛋白表達(dá)水平也明顯降低（P<0.05）。（4） MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染后48、72、96小時(shí)miR-101組細(xì)胞增殖明顯低于B組和NC組（P<0.05），兩對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P>0.05）。（5）流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，miR-101組發(fā)生了G0/G1期阻滯（P<0.05），B組和NC組細(xì)胞周期分布無(wú)顯著差異（P>0.05）。（6）細(xì)胞凋亡率

14、檢測(cè)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，B組、NC組及miR-101組PC-3細(xì)胞凋亡率分別為：2.53±0.36%、2.71±0.42%、9.84±0.83%，miR-101組凋亡率明顯高于兩對(duì)照組（P<0.01）。（7）劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示：miR-101組細(xì)胞遷移能力明顯低于對(duì)照組（P<0.01）；兩對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P>0.05）。（8）Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：miR-101組穿過(guò)Matrigel凝膠的細(xì)胞數(shù)顯著少于B組和N

15、C組（P<0.01），兩對(duì)照組間無(wú)顯著性差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：（1）前列腺癌細(xì)胞中miR-101表達(dá)量較正常前列腺細(xì)胞降低，而EZH2的表達(dá)量則上調(diào)；提示異常表達(dá)的miR-101和EZH2均參與了前列腺癌的發(fā)生發(fā)展；兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)提示EZH2可能是miR-101負(fù)向調(diào)控的靶基因之一。（2）miR-101在AIPC細(xì)胞中表達(dá)水平低于ADPC細(xì)胞，EZH2的表達(dá)則相反；提示兩者可能在激素非依賴性轉(zhuǎn)化過(guò)程中起著一定的作用。