原發(fā)性膽汁性肝硬化比較蛋白質(zhì)組學(xué)的基礎(chǔ)與臨床研究.pdf

1、研究背景及目的: 原發(fā)性膽汁性肝硬化(Primary biliary cirrhosis，PBC)是一種主要以肝內(nèi)中小膽管的非化膿性進(jìn)行性炎性損傷為特征的自身免疫性疾病。PBC起病隱匿，進(jìn)展緩慢，最終可導(dǎo)致肝硬化等終末期肝病，其確切的發(fā)病機(jī)制至今尚不清楚。目前，PBC的診斷主要依據(jù)臨床生化及抗線粒體抗體(AMA)的檢測(cè)，但是臨床上仍有部分AMA陰性的PBC患者容易漏診。熊去氧膽酸(UDCA)是其主要治療藥物，但是其對(duì)某些PBC的

2、遠(yuǎn)期治療效果并不理想。 因而如何早期診斷PBC，如何進(jìn)行有效的干預(yù)處理是PBC研究的一個(gè)方向。由于人體諸多生命功能最終是通過(guò)蛋白質(zhì)來(lái)完成的，在疾病的發(fā)生過(guò)程中，人體內(nèi)蛋白質(zhì)的種類和含量也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的改變，這就為我們對(duì)PBC的研究提供了一個(gè)思路。而蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)正是以蛋白質(zhì)組為研究對(duì)象，分析細(xì)胞內(nèi)、外動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)分子之間的相互作用與聯(lián)系。迄今國(guó)內(nèi)外有關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究P

3、BC的相關(guān)報(bào)道較少。我們從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度出發(fā)，利用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(iTRAQ)聯(lián)合液帽色譜-質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)通過(guò)比較PBC、HBV肝纖維化、HBV肝硬化患者和正常對(duì)照人群的血清蛋白質(zhì)，篩選、鑒定PBC患者血清差異表達(dá)蛋白，并進(jìn)行驗(yàn)證，旨在對(duì)PBC發(fā)病機(jī)制和診治研究提供某些理論依據(jù)。 與此同時(shí)，疾病的動(dòng)物模型也是研究疾病的一個(gè)重要方法。目前PBC動(dòng)物模型大致分為三類：抗原免疫、化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)和基因缺陷。但是這

4、些動(dòng)物模型在肝臟病理變化和/或血清學(xué)生化以及自身抗體的表達(dá)等方面與人類：PBC總是存在一定差異。國(guó)外有文獻(xiàn)報(bào)道部分肝炎患者在利用IFN-α治療的過(guò)程中會(huì)繼發(fā)PBC，而我們?cè)谂R床工作中也有類似發(fā)現(xiàn)，這給了我們一個(gè)建立PBC動(dòng)物模型的啟示-通過(guò)Poly I：C腹腔注射，誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)IFN-α水平升高，進(jìn)而建立PBC動(dòng)物模型。同時(shí)，利用iTRAQ和LC-MS/MS技術(shù)對(duì)不同階段PBC動(dòng)物模型及其對(duì)照組血清及肝臟組織中的蛋白質(zhì)進(jìn)行比較，篩選、鑒

5、定PBC動(dòng)物模型血清及肝組織差異表達(dá)蛋白，并進(jìn)行驗(yàn)證，以期通過(guò)PBC動(dòng)物模型的研究對(duì)人PBC可能的發(fā)病機(jī)制和診斷有所啟示。 方法: 一、PBC動(dòng)物模型建立 1、6-8周齡C57BL/6雌性小鼠80只，體重約20g，隨機(jī)分為PBS對(duì)照組和Poly I：C模型組，SPF級(jí)飼養(yǎng)。PBS液稀釋Poly I：C至1mg/ml。模型組給予Poly I：C5mg/kg腹腔內(nèi)注射2次/周，對(duì)照組給予PBS5mg/kg腹腔內(nèi)注射2

6、次/周；每組分別與第4周、8周、12周和16周各處死10只。 2、血清樣品制備眼球摘除取血，4℃1400g離心5分鐘，取血清，部分血清行生化及自身抗體檢測(cè)，部分血清立即置于-80℃保存?zhèn)溆谩?3、肝臟組織樣品制備斷頸處死后，取肝臟于冰生理鹽水中清洗，部分肝臟置入4％福爾馬林液固定，石蠟包埋，行HE染色和CK19免疫組化染色，光鏡下觀察肝臟病理變化及肝內(nèi)膽管變化；部分肝臟立即置于-80℃保存?zhèn)溆谩?二、PBC動(dòng)物模

7、型血清及肝臟組織差異表達(dá)蛋白篩選、鑒定 1、血清及肝臟組織樣品制備將每組血清各自混合，4℃1400g離心5分鐘，過(guò)柱去除高豐度蛋白；肝臟組織于PBS中剪碎洗去血液；液氮研磨混合；按照裂解液體積：組織重量(v：w)=5：1的關(guān)系加入裂解液(7M尿素，2M硫脲，0.1％PMSF，0.5％DTT)，混懸，冰上裂解半小時(shí)。 2、樣品蛋白質(zhì)定量通過(guò)Bradford法測(cè)定各組樣品中的總蛋白含量。 3、蛋白質(zhì)的消化和標(biāo)記加入還

8、原試劑，60℃反應(yīng)1小時(shí)；加入半胱氨酸封閉試劑，室溫處理10分鐘；每管各加入預(yù)冷的丙酮(丙酮：樣品體積比=5：1)，-20℃沉淀1小時(shí)后，12000 rpm，4℃，離心20分鐘，取沉淀；加入溶解液20μl，混懸，充分溶解樣品；按照酶：蛋白質(zhì)=1：20的比例加入胰蛋白酶，37℃酶解過(guò)夜；iTRAQTM Reagent114，115，116，117分別標(biāo)記正常對(duì)照、4周、12周和16周模型組，共4管，各管標(biāo)記試劑中加入70μl乙醇，混勻，分

9、別加入各管樣品中，室溫反應(yīng)一小時(shí)，之后各加入三倍體積水，使標(biāo)記試劑分解；合并各管標(biāo)記好的樣品，真空冷凍干燥。 4、差異表達(dá)蛋白質(zhì)譜分析、篩選及鑒定不同標(biāo)記的iTRAQ標(biāo)記蛋白樣品混合，經(jīng)第一維強(qiáng)陽(yáng)離子柱(SCX)分離，共收取14個(gè)梯度進(jìn)行第二維分析；第二維反相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(RPLC-MS)，色譜分離70分鐘后行質(zhì)譜鑒定，MS掃描范圍m/z400-1800，MS/MS掃描范圍m/z100-2000。經(jīng)生物信息學(xué)處理，篩選出統(tǒng)計(jì)學(xué)

10、上差異明顯的蛋白質(zhì)峰進(jìn)行搜庫(kù)、鑒定。 三、人PBC血清差異表達(dá)蛋白篩選、鑒定及驗(yàn)證 1、血清樣品制備正常人群對(duì)照、PBC、HBV肝纖維化和HBV肝硬化患者各20例，清晨空腹取血，4℃靜置1小時(shí)，4℃1400g離心5分鐘，取上清，分裝后立即置于-80℃保存?zhèn)溆?；將每組血清各自混合成1管，4℃1400g離心5分鐘，過(guò)柱去除高豐度蛋白。 2、樣品蛋白質(zhì)定量參見動(dòng)物模型樣品蛋白質(zhì)定量。 3、蛋白質(zhì)的消化和標(biāo)記參見

11、動(dòng)物模型的蛋白質(zhì)消化及標(biāo)記。 4、差異表達(dá)蛋白質(zhì)譜分析、篩選及鑒定參見動(dòng)物模型質(zhì)譜分析方法。 5、利用Western免疫印跡技術(shù)驗(yàn)證淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體1(LYVE-1)和鋅-α2糖蛋白(AZGP1)在PBC患者與正常人群血清中的表達(dá)差異；利用ELISA法驗(yàn)證視黃醇結(jié)合蛋白4(RBP4)在PBC患者與正常人群血清中的表達(dá)差異。 結(jié)論: 1、Poly I：C腹腔注射C57BL/6小鼠能夠成功構(gòu)建與人PBC

12、在組織病理和血清學(xué)表現(xiàn)類似的PBC動(dòng)物模型。 2、iTRAQ結(jié)合LC-MS/MS技術(shù)能夠快速、有效地進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究，同時(shí)，我們利用Western免疫印跡技術(shù)和ELISA方法對(duì)部分鑒定蛋白進(jìn)行驗(yàn)證的結(jié)果也證明了iTRAQ結(jié)合LC-MS/MS技術(shù)在蛋白定性及半定量的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方面的可靠性。 3、PBC動(dòng)物模型與對(duì)照組動(dòng)物之間在血清及肝組織的蛋白質(zhì)表達(dá)上均存在明顯差異，在蛋白質(zhì)生物學(xué)功能上分別涉及脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、免

13、疫應(yīng)答、細(xì)胞粘附和運(yùn)動(dòng)、能量代謝等諸多方面；而且部分差異蛋白表達(dá)水平與PBC動(dòng)物模型的進(jìn)程呈現(xiàn)出明顯的正相關(guān)或負(fù)相關(guān)性，這對(duì)于后續(xù)對(duì)該P(yáng)BC模型的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究打下了基礎(chǔ)。 4、PBC患者、HBV肝纖維化患者、HBV肝硬化患者及正常人群其相互之間在血清蛋白質(zhì)表達(dá)上均存在顯著差異，在蛋白質(zhì)生物學(xué)功能上分別涉及脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝、載體類、細(xì)胞粘附及運(yùn)動(dòng)、免疫應(yīng)答、凝血相關(guān)、蛋白水解酶類等諸多方面；特別是相對(duì)于正常

14、人群、HBV肝纖維化及HBV肝硬化患者，我們發(fā)現(xiàn)FN1、GC、LYVE1、A2M、AGT、AlBG、ApoC-Ⅲ、ApoC-Ⅱ和IGHM等9個(gè)蛋白質(zhì)在PBC患者血清中與上述三組均存在顯著的表達(dá)差異，這些蛋白質(zhì)可能與PBC的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，有待于進(jìn)一步研究。 5、通過(guò)對(duì)PBC患者血清差異蛋白質(zhì)組學(xué)與：PBC動(dòng)物模型血清和肝組織差異蛋白質(zhì)組學(xué)的比較研究，我們發(fā)現(xiàn)，諸如ApoC等載脂蛋白家族蛋白在PBC患者及PBC動(dòng)物模型中均呈現(xiàn)低