NAG7基因通過雌激素受體促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)侵襲的分子機(jī)制.pdf

1、【NAG7基因的克隆、生物信息學(xué)特征及前期研究結(jié)果】 NAG7基因是謝奕博士采用定位候選克隆策略結(jié)合生物信息學(xué)方法，從最小共同缺失區(qū)3p25.3-26.3中成功克隆的與鼻咽癌相關(guān)基因。 生物信息學(xué)顯示，NAG7基因cDNA全長1677bp，編碼94個(gè)氨基酸的堿性蛋白質(zhì)，分子量為11023.87道爾頓，預(yù)測(cè)為一跨膜蛋白質(zhì)，其N端位于膜內(nèi)，跨膜區(qū)為33-52位氨基酸，含有1個(gè)蛋白激酶C(PKC)磷酸化位點(diǎn)和1個(gè)肉豆蔻基(My

2、ristyl)化位點(diǎn)。 NAG7基因前期功能研究結(jié)果表明，NAG7基因在鼻咽癌活檢組織和鼻咽癌上皮HNEl細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)甚至缺失，而在正常鼻咽組織中存在明確的表達(dá)；NAG7基因編碼產(chǎn)物為一胞漿蛋白，NAG7基因在鼻咽癌細(xì)胞中的過表達(dá)，可導(dǎo)致鼻咽癌細(xì)胞HNEl蛋白質(zhì)表達(dá)譜和基因表達(dá)譜改變，抑制HNEl細(xì)胞和裸鼠皮下移植瘤生長，細(xì)胞周期素表達(dá)下調(diào)，G0/G1期細(xì)胞增加，S期細(xì)胞減少，凋亡細(xì)胞增加。 【NAG7基因在惡性腫瘤

3、細(xì)胞系中的表達(dá)】 利用RT-PCR技術(shù)分析NAG7基因在七種惡性腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NAG7基因在HNEl、CNEl、6-10B、SW480、Bel-7402和U251等六種惡性腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)減少，而在5-8F細(xì)胞系中呈現(xiàn)高表達(dá)。為了明確NAG7基因在惡性腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)減少是否與其編碼區(qū)序列的突變相關(guān)，進(jìn)一步從這幾種細(xì)胞系的基因組DNA中擴(kuò)增NAG7基因的編碼區(qū)序列并進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果顯示HNEl、CNEl、6-10B

4、、SW480、Bel-7402、U251和5-8F等七種細(xì)胞基因組DNA中均可擴(kuò)增出NAG7基因的編碼區(qū)序列，測(cè)序分析表明HNEl、CNEl、6-10B、SW480、Bel-7402和U251細(xì)胞中擴(kuò)增出來的NAG7基因均在第30位氨基酸的第二個(gè)密碼子發(fā)生了終止突變(NAG7基因編碼序列的第86位，T→G)，而5-8F細(xì)胞中擴(kuò)增出來的NAG7基因?yàn)檎_的編碼區(qū)序列。因此，NAG7基因在這六種惡性腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)下調(diào)可能為基因突變所致。

5、 NAG7基因能明顯抑制鼻咽癌HNEl細(xì)胞體內(nèi)、外生長，并且在不同侵襲轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞系中存在表達(dá)差異(HNEl、CNEl、6-10B、SW480、Bel-7402和U251等六種低/無侵襲轉(zhuǎn)移潛能惡性腫瘤細(xì)胞系表達(dá)減少，高侵襲轉(zhuǎn)移潛能的5-8F細(xì)胞系高表達(dá))和序列突變(無/低侵襲轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞系中氨基酸第29位終止突變)。NAG7在不同侵襲轉(zhuǎn)移潛能的惡性腫瘤細(xì)胞系，特別是在5-8F和6-10B細(xì)胞系中存在差異表達(dá)，因此提出假設(shè)：NAG

6、7基因是否參與了鼻咽癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移? 【NAG7基因促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的表型研究】 根據(jù) NAG7基因的表達(dá)水平和細(xì)胞系的侵襲轉(zhuǎn)移潛能，選擇3種細(xì)胞系作為研究對(duì)象：高侵襲轉(zhuǎn)移能力的5-8F、低侵襲轉(zhuǎn)移能力的HNEl和無侵襲轉(zhuǎn)移能力的6-10B。由于NAG7基因序列中未能預(yù)測(cè)到合適的RNAi序列，不能對(duì)5-8F細(xì)胞達(dá)到有效的干擾效果，因此構(gòu)建NAG7真核表達(dá)載體pEGFP-C2/NAG7，考察NAG7基因在6-10B

7、細(xì)胞和HNEl細(xì)胞中的過表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)侵襲表型的影響。研究發(fā)現(xiàn)，NAG7基因能夠增加鼻咽癌細(xì)胞HNEl和6-10B與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附，增加HNEl和6.10B細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附，及增強(qiáng)HNEl細(xì)胞的侵襲能力和運(yùn)動(dòng)遷移能力，但對(duì)6-10B細(xì)胞作用甚微。NAG7基因不能恢復(fù)HNEl和6-10B細(xì)胞的細(xì)胞間隙連接通訊能力。此外，NAG7基因還可以提高人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管生成能力。小鼠腎包膜下移植瘤實(shí)驗(yàn)顯示，雖未發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)出現(xiàn)明顯腫瘤轉(zhuǎn)

8、移灶，但NAG7基因轉(zhuǎn)染的HNEl細(xì)胞明顯向腎內(nèi)侵襲，范圍和深度均顯著大于HNEl細(xì)胞，NAG7基因能明顯促進(jìn)HNEl細(xì)胞向腎內(nèi)的侵襲。NAG7基因能夠明顯促進(jìn)鼻咽癌HNEl細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)侵襲潛能，但是對(duì)6-10B細(xì)胞作用甚微，說明NAG7基因并不具備啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)侵襲的作用，而是能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)侵襲潛能。 【NAG7基因通過雌激素受體促進(jìn)鼻咽癌HNEl細(xì)胞運(yùn)動(dòng)侵襲的分子機(jī)制】 利用人腫瘤相關(guān)寡核苷酸芯片篩選NAG7基

9、因調(diào)控鼻咽癌HNEl細(xì)胞的基因差異表達(dá)譜，根據(jù)芯片位點(diǎn)雜交的信號(hào)強(qiáng)度和t檢驗(yàn)結(jié)合兩倍差異的標(biāo)準(zhǔn)，從2747個(gè)基因中篩選出差異表達(dá)基因共101個(gè)，其中上調(diào)34個(gè)，下調(diào)67個(gè)基因。選擇CAVl和MMPl基因，qRT-PCR.驗(yàn)證其在NAG7/HNEl和HNEl細(xì)胞中的表達(dá)，并與基因芯片結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)表達(dá)量的改變與芯片結(jié)果較一致，說明芯片結(jié)果較準(zhǔn)確地反映了基因表達(dá)的變化。結(jié)合基因功能分類體系Gene Ontology(GO)，對(duì)差異表達(dá)基