抗Ⅳ型膠原酶單域抗體V-,H-導(dǎo)向的力達(dá)霉素基因工程菌株的構(gòu)建及融合蛋白CagA-V-,H-的表達(dá)研究.pdf

1、力達(dá)霉素(lidamycin，LDM)，原名C-1027，是一種新型的烯二炔類抗腫瘤抗生素，由球孢鏈霉菌C-1027(StreptomycesglobisporusC-1027)產(chǎn)生。其抗腫瘤活性比臨床常用的阿霉素強(qiáng)10，000倍，已經(jīng)進(jìn)入臨床II期試驗(yàn)。力達(dá)霉素由一個(gè)酸性輔基蛋白CagA(C-1027apoprotein、C-1027AG，也寫作LDP)和一個(gè)烯二炔結(jié)構(gòu)的發(fā)色團(tuán)(chromophore，也寫作LDC)非共價(jià)結(jié)合組成，發(fā)

2、色團(tuán)為活性組分，輔基蛋白保護(hù)和運(yùn)載發(fā)色團(tuán)。由于力達(dá)霉素自身具有輔基蛋白，可以將其與抗腫瘤抗體偶聯(lián)成為融合蛋白，改造為靶向特異腫瘤的載體，構(gòu)建導(dǎo)向性力達(dá)霉素。IV型膠原酶降解細(xì)胞基底膜中的Ⅳ型膠原，破壞基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)的完整性，引起腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，IV型膠原酶已經(jīng)成為抗腫瘤研究的靶標(biāo)?？笽V型膠原酶抗體可以抑制IV型膠原酶的活性并可作為導(dǎo)向藥物的載體。
　　 本工作根據(jù)已知的抗IV型膠原酶單鏈抗體基因序列，設(shè)計(jì)合成了具有鏈

3、霉菌偏好密碼子的抗IV型膠原酶單域抗體VH(抗IV型膠原酶抗體重鏈可變區(qū))基因，構(gòu)建了含有輔基蛋白與抗IV型膠原酶單域抗體融合蛋白基因cagA-VH和用于篩選的阿普霉素抗性基因aac(3)IV的重組質(zhì)粒pBSH，用接合轉(zhuǎn)移的方法導(dǎo)入力達(dá)霉素產(chǎn)生菌S.globisporusC-1027，通過(guò)同源重組雙交換，以cagA-VH-aac(3)IV取代力達(dá)霉素生物合成基因簇中原有的輔基蛋白基因cagA，得到基因工程菌株S.globisporusC

4、-1027VH，以獲得Ⅳ型膠原酶靶向的力達(dá)霉素。對(duì)基因工程菌株進(jìn)行發(fā)酵，以枯草桿菌(Bacillussubtilis)為檢定菌，結(jié)果表明基因工程菌株發(fā)酵液具有一定的抑菌活性，但與原產(chǎn)生菌相比活性較低。經(jīng)Westernblot分析在胞內(nèi)能檢測(cè)到融合蛋白和降解的輔基蛋白，而胞外僅檢測(cè)到降解的輔基蛋白條帶。ELISA檢測(cè)到融合蛋白的免疫活性。同時(shí)構(gòu)建了含有融合蛋白基因cagA-VH但不含抗性基因的重組質(zhì)粒pBS03H，通過(guò)同源重組雙交換，以c

5、agA-VH基因取代cagA基因，得到僅融合了抗IV型膠原酶單域抗體基因的基因工程菌株S.globisporusC-1027NVH。同樣進(jìn)行了發(fā)酵、抑菌活性、SDS-PAGE和Westernblot的檢測(cè)，結(jié)果與S.globisporusC-1027VH基本相同。
　　 為了增加融合蛋白的表達(dá)量，獲得高活性的導(dǎo)向性力達(dá)霉素，本工作進(jìn)一步構(gòu)建了輔基蛋白阻斷株，并通過(guò)導(dǎo)入多拷貝的融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的策略來(lái)提高融合蛋白的表達(dá)量。構(gòu)建重組

6、質(zhì)粒pBSA，將質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移至S.globisporusC-1027中，采用同源重組雙交換的方法將cagA基因阻斷。通過(guò)抗性篩選、PCR和Southernblot驗(yàn)證，最終獲得輔基蛋白阻斷株，命名為S.globisporusAKO。用四種輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒pKCTA900、pSETTA900、pLTA900和pLTA400分別導(dǎo)入在自身啟動(dòng)子和/或強(qiáng)啟動(dòng)子控制下的cagA基因?qū)ψ钄嗤蛔冎闟.globisporusAKO進(jìn)行互補(bǔ)，得到相應(yīng)的

7、互補(bǔ)菌株。對(duì)阻斷株和互補(bǔ)菌株進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液的抑菌活性和HPLC分析結(jié)果表明阻斷株完全喪失了力達(dá)霉素的產(chǎn)生能力，而互補(bǔ)菌株能不同程度地恢復(fù)產(chǎn)生力達(dá)霉素，其中S.globisporusAKO/pKCTA900基本恢復(fù)到野生株的水平。將質(zhì)粒pKCA900、pSETA900、pLA900和pLA400接合轉(zhuǎn)移至野生株S.globisporusC-1027中構(gòu)建了相應(yīng)的輔基蛋白過(guò)表達(dá)菌株。抑菌活性和HPLC分析結(jié)果表明過(guò)量表達(dá)cagA基因可以提

8、高力達(dá)霉素的產(chǎn)量。
　　 構(gòu)建輔基蛋白.單域抗體的融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒pKCTH2600、pSETTH2600分別導(dǎo)入輔基蛋白阻斷株中進(jìn)行表達(dá)。重組菌株S.globisporusAKO/pKCTH2600發(fā)酵液的抑菌活性在發(fā)酵晚期與野生株相當(dāng)，經(jīng)Western1blot分析在胞內(nèi)、胞外均能檢測(cè)到融合蛋白的特異條帶。ELISA檢測(cè)到融合蛋白的免疫活性。結(jié)果表明融合蛋白在輔基蛋白阻斷株中以多拷貝質(zhì)粒的形式獲得表達(dá)且表達(dá)量較基因工程菌株S