基于量子點技術(shù)同步檢測輸血傳染病病原體抗原的方法建立.pdf

1、目的與意義： 在獻血及輸血治療的過程中， HBV、HCV、HIV-1/2以及TP的檢測是國家強制性檢測項目，HBV與HCV是造成輸血后肝炎的主要病原體。目前對上述多種病原微生物的實驗室診斷方法較多，但各有不足。如ELISA無法同步檢測多項指標、時間較長，金標法靈敏度較低，PCR和化學(xué)發(fā)光法需借助特殊設(shè)備，對實驗室要求較高等。 為解決輸血性傳染病的多種病原體的抗原同步檢測，本研究擬以乙肝表面抗原和丙肝核心抗原的同步檢測為例

2、，建立一種高靈敏度和特異性、穩(wěn)定性好的抗原同步快速檢測體系。將量子點技術(shù)與磁微粒技術(shù)相結(jié)合，以磁微粒富集以提高靈敏度，利用不同量子點在相同波長激發(fā)光下發(fā)射不同熒光的特性達到同步檢測的目的。為建立針對多種輸血傳染病病原體抗原的同步檢測液相芯片奠定基礎(chǔ)。 材料與方法： 1.磁微粒的活化及其與抗體的連接：選擇粒徑3μm的羧基化磁微粒，采用碳二亞胺共價交聯(lián)法，在活化劑EDC與NHS的不同濃度組合條件下活化磁微粒，選擇最適的活化劑

3、濃度組合。以不同濃度的鼠抗HBsAg-IgG、鼠抗HCcAg-IgG連接磁微粒，在不同反應(yīng)時間、pH值的條件組合下考察抗體與磁微粒的連接效果，以Folin-酚法評價抗體連接效率。 2.量子點的活化及其與抗體的連接：采用碳二亞胺共價交聯(lián)法以EDC及NHS活化發(fā)射波長為581nm、618nm的羧基化CdSe量子點，以不同濃度的兔抗HBsAg-IgG、兔抗HCcAg-IgG連接量子點并在不同反應(yīng)時間、pH值的條件組合下考察抗體與磁微粒

4、的連接效果，以Folin-酚法評價抗體連接效率。 3.單指標檢測的體系建立：以連接抗體的量子點作為熒光標記物，以連接抗體的磁微粒為載體作固-液分離，確定最適標本檢測時間。作陰性血清檢測以檢測熒光強度并以2倍陰性對照均值+空白對照均值作為單指標檢測Cut off值判讀結(jié)果。對不同濃度的HBsAg、HCcAg抗原標準品作單指標檢測以確定檢測范圍。并作重復(fù)性實驗和準確度評價。 4.同步檢測HBsAg和HCcAg體系的建立：在單

5、指標檢測的基礎(chǔ)上整合反應(yīng)條件及最適標本檢測時間，作陰性血清檢測以檢測熒光強度并以2倍陰性對照均值+空白對照均值作為單指標檢測Cut o.ff值判讀結(jié)果。混合激發(fā)光的記錄以濾光片濾去一種顏色光線后記錄一項結(jié)果，更換濾光片后記錄另一結(jié)果。 5.對不同濃度HBsAg、HCcAg抗原標準品混合物作同步檢測以確定檢測范圍。 6.對188例臨床標本進行檢測，并與ELISA試劑盒檢測結(jié)果相比較。 7.選取10ng/mL、100

6、ng/mL、1μg/mL三個濃度抗原標準品作同步檢測的批內(nèi)、天間重復(fù)性實驗。 8.以脂血、溶血、黃疸標本作干擾實驗。以HAV、TP抗體陽性標本作特異性實驗。 9.將準備好的試劑及反應(yīng)后的復(fù)合物于4℃保存一定時間后觀察保存時間對檢測效果的影響。 主要結(jié)果： 1.磁微粒的選擇及連接抗體的條件選擇：鼠抗HBsAg-IgG連接磁微粒的活化劑濃度為EDC6mg/L、NHS4mg/L，連接時間120min，最適pH值

7、6.6，最適濃度20mg/mL，連接效率41％，并制備試劑1(RIHBV)。 鼠抗HCcAg-IgG連接磁微粒的活化劑濃度為EDC4mg/L、NHS4mg/L，連接時間120min，最適pH值6.6，最適濃度20mg/mL，連接效率44％，并制備試劑2(R2HBV)。 上述RIHBV、RIHCV清洗后加入l％BSA封閉磁微粒表面剩余位點過夜。 2.量子點連接抗體的條件選擇：兔抗HBsAg-IgG連接581nm量子

8、點，連接時間120min，最適pH值6.2，最適濃度20mg/mL，連接效率45％，并制備試劑1(R1HCV)。 兔抗HBsAg-IgG連接581nm量子點，連接時間120min，最適pH值6.2，最適濃度10mg/mL，連接效率45％，并制備試劑2(R2HCV)。 3.量子點磁微粒單指標檢測體系：于EP管內(nèi)同時加入標本50μL，Rl各100μL，R2各5μL，反應(yīng)體系pH值7.4，計算Cut off值為122和136(

9、HBsAb與HCcAg)，檢測范圍為2ng/mL-10μg/mL、5ng/mL-5μg/mL。檢測時間分別縮短到30min、40min。 4.量子點磁微粒體系單項檢測HBsAg和HCcAg標準品，批內(nèi)重復(fù)性實驗平均CV值為9.7％、9.8％；天間重復(fù)性實驗平均CV值為10.3％、10.1％。 5.量子點磁微粒同步檢測體系：于EP管內(nèi)同時加入標本5100μL，R1各100μL，R2各5μL，反應(yīng)體系pH值7.4，計算Cut

10、 off值為133/140，檢測范圍為2ng/mL-10μg/mL，5ng/mL-5μg/mL。檢測時間從th/3h同步縮短到40min。 6.對188份臨床標本的同步檢測結(jié)果，HBsAg陽性：PCR方法36例，量子點-磁微粒法35例，ELISA方法34例。HCcAg陽性：PCR方法11例，量子點.磁微粒法11例， ELISA方法8例。對2例HBV與HCV混合感染的臨床標本及5例標準品混合樣本成功檢出。HBsAg檢測結(jié)果與PCR

11、方法比較，符合率98.4％，靈敏度94.4％，特異度99.3％； HCcAg檢測結(jié)果與ELISA方法比較符合率97.9％，靈敏度81.8％，特異度98.9％。 7.同步檢測HBsAg和HCcAg標準品，批內(nèi)重復(fù)性實驗平均CV值為10.0％、10.1％；天間重復(fù)性實驗平均CV值為10.7％、10.6％。 8.檢測肉眼可見的溶血、黃疸、脂血標本，對結(jié)果無干擾。與其它常見致輸血后感染的病原體(TP、HAV)無交叉反應(yīng)。

12、 9.試劑R1、R2于4℃保存4周后使用，與新配置試劑檢測標準品結(jié)果無顯著差異。結(jié)合目標抗原后的復(fù)合物標本，經(jīng)4℃放置4周后熒光強度無明顯衰減。最長放置8周后仍可檢出熒光。 結(jié)論： 1.本研究利用不同量子點在相同激發(fā)光照射下可發(fā)射不同顏色熒光的特性，選用輸血傳染病中造成輸血后肝炎的兩種主要病原體HBV和HCV的抗原檢測為例，成功達到了同步檢測不同抗原的目的，為建立針對多種輸血傳染病病原體抗原的檢測體系建立奠定了基礎(chǔ)。同時

13、由于針對抗原作檢測，相對抗體檢測較大幅度提前了陽性檢出時間，避免了因抗體形成的窗口期造成的漏檢。 2.以碳二亞胺法連接了不同源的抗體于羧基化磁微粒和量子點表面，以雙抗體夾心法檢測抗原，由于采用磁微粒作為固相載體，在不借助大型特殊設(shè)備的條件下獲得了較高的靈敏度，對HBsAg與HCcAg檢測靈敏度分別為2ng/mL、5ng/mL。 3.對臨床標本的檢測結(jié)果與ELISA試劑比較無顯著性差異，但檢測時間明顯縮短，對HBsAg與H