量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)檢測肺炎支原體抗原的應(yīng)用分析.pdf

1、前言:
　　 肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae,Mp)是引起人類原發(fā)性非典型肺炎、支氣管炎、咽炎等呼吸道疾病的常見病原體,除呼吸道外,尚可引起其它多系統(tǒng)、多器官的肺外并發(fā)癥。肺炎支原體沒有細(xì)胞壁,對作用于細(xì)胞壁的抗生素不敏感。因此,Mp感染的病原學(xué)診斷對于疾病的及時正確治療有重要意義。對Mp感染的實驗室診斷,主要是通過支原體分離培養(yǎng)、血清學(xué)檢測和分子生物學(xué)方法檢測核酸,而這些方法存在著各自不同的優(yōu)缺點(diǎn),因此

2、,到目前為止,國內(nèi)外對Mp的實驗室診斷沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。目前肺炎支原體診斷方法中所存在的局限性更突顯了建立一種高靈敏度、高特異性、經(jīng)濟(jì)方便的檢測方法的迫切需求。本研究基于QDs標(biāo)記技術(shù),通過建立鼠肺炎支原體感染模型,探討QDs標(biāo)記技術(shù)檢測肺炎支原體的特點(diǎn)及在臨床應(yīng)用的可行性。
　　 方法:
　　 1、量子點(diǎn)標(biāo)記兔抗肺炎支原體P1重組蛋白的IgG抗體制備。
　　 采用碳二亞胺鹽連接法,使量子點(diǎn)QD605的羧基與抗體上

3、的氨基反應(yīng),形成肽鍵。然后用離心法純化偶聯(lián)產(chǎn)物,純化后采用膜直接免疫熒光法驗證量子點(diǎn)QD605與抗體的偶聯(lián),并采用熒光分光光度法對其熒光效率進(jìn)行檢測。
　　 2、建立鼠肺炎支原體感染模型。
　　 3、以CdSe/ZnS量子點(diǎn)標(biāo)記兔抗肺炎支原體P1重組蛋白IgO作為檢測抗體,對不同感染時期的鼠支氣管灌洗液標(biāo)本進(jìn)行檢測,觀察CdSe/ZnS量子點(diǎn)標(biāo)記方法檢測肺炎支原體感染陽性率與病程的關(guān)系。
　　 4、用CdSc/Z

4、nS量子點(diǎn)標(biāo)記方法對105份臨床呼吸道感染標(biāo)本進(jìn)行測定,并與聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測法進(jìn)行比較,計算兩種方法的符合率。
　　 結(jié)果:
　　 1、量子點(diǎn)與肺炎支原體P1重組蛋白多克隆抗體的偶聯(lián)結(jié)果
　　 膜直接免疫熒光法表明只有偶聯(lián)產(chǎn)物與Mp抗原反應(yīng)在紫外燈下發(fā)熒光,單獨(dú)的量子點(diǎn)QD60s、未標(biāo)記的抗體及其它對照與Mp抗原反應(yīng)在紫外燈下均不發(fā)熒光,驗證了量子點(diǎn)QD605與抗體的偶聯(lián)。然后采用熒光分光光度法對量子點(diǎn)

5、QD605及偶聯(lián)產(chǎn)物的熒光效率進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示兩者并沒有明顯的改變,說明偶聯(lián)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度沒有受到偶聯(lián)過程的影響。
　　 2、動物實驗感染的一般狀況及肺指數(shù)測定
　　 感染肺炎支原體后小鼠的肺指數(shù)明顯升高,其中感染后3天和7天升高明顯,分別為2.78%和2.99%,隨著病程的延長肺指數(shù)逐漸下降。
　　 3、量子點(diǎn)標(biāo)記抗體法及PCR法檢測感染鼠標(biāo)本中Mp抗原
　　 小鼠感染第3天和第7天PCR檢測陽性率為

6、分別為91.7%和100%,量子點(diǎn)標(biāo)記抗體法陽性率分別為75%和83.3%。隨著病程進(jìn)展兩種檢測方法的檢測陽性率逐漸下降。
　　 4、105份臨床標(biāo)本檢測結(jié)果
　　 PCR陽性率為35.2%(37/105);量子點(diǎn)標(biāo)記方法陽性率為31.4%(33/105),略低于PCR檢測方法,兩者符合率達(dá)86.7%(91/105),經(jīng)x2檢驗,兩方法的檢測結(jié)果無顯著性差異(x2-0.643,P＞0.05)。
　　 結(jié)論: