真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白(FIP)在畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115中的重組表達(dá)及其生物學(xué)活性的研究.pdf

1、真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白是一類從大型食（藥）用真菌中提取出來的具有免疫調(diào)節(jié)活性的小分子蛋白。到目前為止，共有七種真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白分別從靈芝、松杉靈芝、金針菇、草菇、紫芝、小孢子靈芝和甜芝中被發(fā)現(xiàn)。真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白具有和凝集素相類似的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能，其免疫調(diào)節(jié)活性主要表現(xiàn)為促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子（白介素、腫瘤壞死因子、干擾素等）。另外，真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白具有一定的抗腫瘤活性。 本論文從靈芝菌絲體和金針菇子實體基因組

2、中克隆出編碼兩種真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白（LZ-8和FIP—fve）的基因，構(gòu)建了畢赤酵母GS115重組表達(dá)這兩種蛋白的載體pPIC9—LZ-8和pPIC9—FIP—fve。通過電轉(zhuǎn)化法將目的基因轉(zhuǎn)化至酵母中，經(jīng)組氨酸缺失培養(yǎng)基篩選和PCR鑒定獲得正確的酵母轉(zhuǎn)化子。將重組的酵母菌進(jìn)行液體搖瓶振蕩培養(yǎng)并通過添加甲醇誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)，重組蛋白的表達(dá)量可達(dá)191 mg L-1（reLZ-8）和158 mg L-1（reFIP—fve）。重組蛋白的發(fā)

3、酵液經(jīng)過超濾膜超濾，DEAE—A25葡聚糖離子柱層析，HPLC層析，低溫透析和冷凍干燥后獲得純化的重組蛋白，蛋白純度達(dá)到85％以上。Western blot結(jié)果表明重組表達(dá)的蛋白為正確表達(dá)的目的蛋白。對重組蛋白的氨基酸組分分析表明重組表達(dá)的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白具有和天然蛋白相同的氨基酸組分。圓二色譜（CD）分析檢測出的重組蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)單元具有和天然蛋白一致的二級結(jié)構(gòu)比例，說明畢赤酵母表達(dá)的重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白能夠正確折疊且形成具有生物學(xué)活

4、性的形式。糖含量分析表明重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白分別含有1．8％和1．2％的中性糖，比天然的蛋白稍高，說明重組免疫調(diào)節(jié)蛋白在酵母表達(dá)系統(tǒng)中有可能發(fā)生了糖基化修飾。 重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白純化后，對其生物學(xué)活性進(jìn)行了測定。血細(xì)胞凝集實驗表明，重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白表現(xiàn)出與天然免疫調(diào)節(jié)蛋白一致的血細(xì)胞凝集活性和特異性。采用MTT法測定的結(jié)果表明，重組蛋白具有促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的活性。間接ELISA方法檢測的重組蛋白對細(xì)胞因子分泌作用的結(jié)

5、果表明，重組靈芝和金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白均可明顯提高小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子—白介素2（IL-2）。此外，采用流式細(xì)胞術(shù)測定重組免疫調(diào)節(jié)蛋白的體外抗腫瘤活性表明，重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白對人類早期白細(xì)胞NB4具有明顯的殺傷作用，最大抑制率為32％，其作用機(jī)制可能是誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡。 本論文獲得了兩種真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白在畢赤酵母GS115中的高效重組表達(dá)，并證實了重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白具有和天然蛋白相類似的生物學(xué)活性。這些研究結(jié)果將為深入研