內(nèi)源性n-3多不飽和脂肪酸對fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓成脂的影響.pdf

1、骨質(zhì)疏松是一種在絕經(jīng)期婦女和老齡化人群中發(fā)病率很高的臨床疾病，發(fā)病的根本原因在于骨形成和骨重吸收間的平衡被打破，會導(dǎo)致病理性骨折等其他一系列嚴重的并發(fā)癥[1]。研究表明，年齡相關(guān)的骨質(zhì)疏松通常伴隨著骨髓內(nèi)脂肪細胞的增多和骨丟失，而且在發(fā)生骨質(zhì)疏松的骨里，減少的骨形成與增加的脂肪組織有直接的關(guān)聯(lián)性。
　　 成骨細胞(OB，osteoblast)與骨髓的脂肪細胞(AD，adipocyte)都由共同的前體細胞分化而來，即骨髓間充質(zhì)干細

2、胞(BMSCs，bone marrowmesenchymal stem cells)。體外實驗已經(jīng)顯示，與健康的女性相比，來自于絕經(jīng)期婦女體內(nèi)的骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)過培養(yǎng)，更容易分化為脂肪細胞而非成骨細胞。成骨細胞與脂肪細胞都有很強的分化可塑性，由人體間充質(zhì)干細胞完全分化成熟的成骨細胞表現(xiàn)出了分化轉(zhuǎn)化為脂肪細胞的能力，反之亦然。還有報道發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞分化為脂肪細胞或者成骨細胞，完全是一種骨髓內(nèi)的平衡狀態(tài)。Beresford JN等的研

3、究表明了脂肪細胞系分化與成骨細胞系分化之間此消彼長的關(guān)系。
　　 此外，Aline Clabaut等采用體外共培養(yǎng)系統(tǒng)進行研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞來源的脂肪細胞能夠誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞來源的成骨細胞分化出脂肪細胞的表型。另一方面，大量的實驗研究指出，脂肪細胞能夠分泌許多細胞因子，如荷爾蒙、瘦素、脂聯(lián)素、脂肪酸等，這些細胞因子直接影響著周圍細胞的增殖、凋亡和功能。Alexandre Elbaza的研究證明，骨髓中的脂肪細胞對成骨細胞存在

4、脂毒性作用。除此之外，最近實驗結(jié)果指出，在PGE2(prostaglandinE2，前列腺素E2)缺乏的情況下，與成骨細胞前提細胞相比，脂肪細胞前體細胞具有更強的促使破骨細胞(OC，osteoclast)樣細胞形成的作用，這表明在骨髓細胞成脂分化和破骨分化間存在一種新興的關(guān)聯(lián)。
　　 現(xiàn)有的證據(jù)已經(jīng)表明，骨髓內(nèi)脂肪的積累可能在骨質(zhì)疏松的起病中扮演著非常重要的作用，而此作用主要歸因于其潛在的對骨髓基質(zhì)干細胞分化和（或）破骨細胞調(diào)控

5、的骨重吸收穩(wěn)態(tài)的影響。鑒于此觀點，逆轉(zhuǎn)骨髓內(nèi)脂肪形成或許是防治年齡相關(guān)性骨質(zhì)疏松的有效治療方案。
　　 N-3長鏈多不飽和脂肪酸（PUFAs，polyunsaturated fatty acids）是人體的必須脂肪酸，人體自身無法合成，如亞麻酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸。在過去的幾十年中，無論是體外還是體內(nèi)試驗，都證明了n-3 PUFAs對于抵抗骨丟失的積極作用。但是n-3PUFAs保護骨組織健康的潛在作用機制卻并沒有得到完

6、全的闡明。部分研究稱，n-3PUFAs抑制破骨細胞分化與活化的作用可能是其抵抗骨質(zhì)疏松的機制之一。
　　 目的:據(jù)我們所了解，至今還沒有關(guān)于n-3PUFAs對骨髓內(nèi)脂肪形成的作用與機制的科學(xué)研究。本實驗選用一種過度表達fat-1基因的轉(zhuǎn)基因小鼠作為動物模型，此種小鼠體內(nèi)的fat-1基因來自線蟲體內(nèi)，能夠?qū)-6 PUFAs內(nèi)源性轉(zhuǎn)化為n-3PUFAs。本文通過轉(zhuǎn)基因動物模型，探討在骨質(zhì)疏松狀態(tài)下內(nèi)源性n-3PUFAs對骨髓內(nèi)脂肪

7、形成的影響，旨在為當(dāng)前臨床防治骨質(zhì)疏松癥提供新的視角。
　　 方法:本研究旨在通過轉(zhuǎn)基因動物模型在體內(nèi)水平探討內(nèi)源性n-3PUFAs對骨髓內(nèi)脂肪形成的影響及其分子機制。采用PCR技術(shù)分別鑒定出fat-1基因陽性表達(fat-1組)和陰性表達的C57BL6小鼠（野生型組），建立去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠模型。術(shù)后3個月，運用micro-CT檢測內(nèi)源性n-3 PUFAs對去卵巢誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松的at-1小鼠骨組織形態(tài)微結(jié)構(gòu)的影響，并采用組織形態(tài)

8、分析技術(shù)、免疫組織化學(xué)技術(shù)、免疫熒光技術(shù)檢測內(nèi)源性n-3 PUFAs對去fat-1小鼠骨髓內(nèi)脂肪形成的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1、內(nèi)源性n-3 PUFAs對去卵巢骨質(zhì)疏松誘導(dǎo)小鼠模型體重、腹部脂肪的影響
　　 去卵巢組小鼠的卵巢重量與假手術(shù)組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異，確定去卵巢誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松模型成功建立。與去卵巢野生型組相比，術(shù)后3個月，去卵巢fat-1小鼠的體重與腹部脂肪組織重量均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，但是

9、體重與腹部脂肪組織重量在假手術(shù)的fat-1和野生型小鼠之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。去卵巢小鼠的體重比假手術(shù)對照組小鼠的體重更高(P＜0.05)。
　　 2、內(nèi)源性n-3 PUFAs對骨微結(jié)構(gòu)的影響
　　 Micro-CT(micro computed tomography)掃描結(jié)果顯示:與假手術(shù)組相比，去卵巢小鼠股骨掃描區(qū)域的BMD（骨密度）、BMC（骨礦物含量）、BV/TV（骨體積/總體積）和Tb.N（骨小梁數(shù)

10、）較低，且有顯著性差異(P＜0.05)。去卵巢fat-1、鼠股骨遠端的BMD，BV/TV和BMC的值都比去卵巢野生型小鼠高(P＜0.05)，但是，與去卵巢fat-1小鼠相比，去卵巢野生型小鼠股骨遠端的TB.N的值僅輕微減低(P＞0.05)。此四項骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)fat-1假手術(shù)組和野生型假手術(shù)組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 3、內(nèi)源性n-3 PUFAs對骨髓脂肪的影響
　　 組織形態(tài)學(xué)分析結(jié)果顯示:在野生型或fat-1小鼠組里

11、，與假手術(shù)組相比，去卵巢小鼠骨髓內(nèi)脂肪細胞的數(shù)量均顯著增多(P＜0.05)。脂肪細胞參數(shù):AV/TV（脂肪體積/總體積）與AD#的組織學(xué)分析結(jié)果同樣顯示，相對于去卵巢fat-1小鼠，去卵巢野生型小鼠骨髓內(nèi)出現(xiàn)更多的脂肪聚集，切具有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 4、內(nèi)源性PUFAs對骨髓內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子PPARγ與RUNX2表達的影響
　　 PPARγ是成脂過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[28]，其表達與活性的水平高低決定了骨髓間充

12、質(zhì)干細胞向成骨細胞系還是脂肪細胞系分化[29]。免疫熒光結(jié)果顯示:卵巢切除會顯著提高小鼠骨髓內(nèi)PPARγ的表達(P＜0.05)，而且與野生型去卵巢小鼠相比，fat-1去卵巢小鼠骨髓內(nèi)PPARγ表達顯著降低(P＜0.05)。野生型與fat-1假手術(shù)組小鼠間PPARγ的表達并無明顯差別。
　　 RUNX2作為成骨細胞分化過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子，在骨形成中發(fā)揮著重要的作用[30]。免疫組化結(jié)果顯示:相對于去卵巢組小鼠，假手術(shù)組小鼠骨髓內(nèi)