機(jī)械拉伸對成骨細(xì)胞基因表達(dá)及可變剪接的研究.pdf

1、人體內(nèi)許多組織和器官都受到來自生理環(huán)境的不同類型和大小的應(yīng)力作用,骨是人體內(nèi)重要的結(jié)構(gòu)和功能組織,研究應(yīng)力作用對骨組織生長發(fā)育的影響有助于骨組織修復(fù)工程的發(fā)展。應(yīng)力刺激可以改變細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)和可變剪接過程,本文利用生物力學(xué)、分子生物學(xué)等手段研究拉伸刺激對成骨細(xì)胞內(nèi)力響應(yīng)基因的表達(dá)和可變剪接的影響,以及可能的可變剪接調(diào)控機(jī)制。
　　主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1和人永生化表皮細(xì)胞株HaCaT

2、,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)良好,MC3T3-E1細(xì)胞呈纖維樣細(xì)胞型,HaCaT細(xì)胞呈上皮樣細(xì)胞型。
　　將成骨細(xì)胞 MC3T3-E1接種到硅橡膠膜上,應(yīng)用自主設(shè)計(jì)制作的應(yīng)力拉伸裝置對MC3T3-E1細(xì)胞施加拉伸刺激,加載參數(shù)為:應(yīng)變量15％、頻率30次/min、加載時(shí)間分別為3h和6h,收集細(xì)胞提取總mRNA和蛋白,研究拉伸刺激對VEGF、CD44和cyclinD1基因表達(dá)的影響。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)拉伸前后VEGF基因主要表

3、達(dá)剪接變異體VEGF188、VEGF164和VEGF120,CD44基因主要表達(dá)剪接變異體CD44S和CD44E,cyclinD1基因主要表達(dá)剪接變異體cyclinD1a。利用q-PCR和western blot檢測表達(dá)量變化發(fā)現(xiàn)拉伸刺激后VEGF及其剪接變異體VEGF164和VEGF120表達(dá)量明顯上調(diào),cyclinD1及其剪接變異體cyclinD1a表達(dá)量明顯下調(diào),而CD44及其剪接變異體CD44S和CD44E表達(dá)量改變不明顯。

4、r>　　構(gòu)建剪接因子 ASF/SF2、SC35和 hnRNPA1的真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3.1(+)-EGFP-ASF/SF2、pcDNA3.1(+)-EGFP-SC35和pcDNA3.1(+)-EGFP-hnRNPA1,轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞以模擬拉伸刺激后細(xì)胞內(nèi)剪接因子ASF/SF2、SC35和hnRNPA1表達(dá)上調(diào)的狀態(tài),研究應(yīng)力拉伸環(huán)境下剪接因子ASF/SF2、SC35和hnRNPA1對VEGF基因可變剪接的影響。熒光顯微鏡下觀察