兩種中藥復(fù)方的免疫增強(qiáng)作用和機(jī)理研究.pdf

1、免疫增強(qiáng)劑對(duì)提高疫苗的免疫原性、增強(qiáng)動(dòng)物傳染性疾病的防制效果具有重要意義。同時(shí),增強(qiáng)免疫、提高機(jī)體的抗病力也是防治動(dòng)物普通疾病的重要措施。本研究為兩個(gè)國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目的部分內(nèi)容。一是探討了兩個(gè)中藥成分復(fù)方的免疫增強(qiáng)作用和機(jī)理,為研制開(kāi)發(fā)新型中藥免疫增強(qiáng)劑奠定基礎(chǔ)；二是從免疫學(xué)的角度研究了中藥新促孕液防治母畜子宮內(nèi)膜炎的藥理作用,為改進(jìn)中藥新促孕液的組方、提高其療效提供理論依據(jù)。試驗(yàn)分為以下八個(gè)部分。 試驗(yàn)Ⅰ、中藥成分復(fù)方和相

2、應(yīng)的中藥復(fù)方的制備 分別用水煎醇沉法提取淫羊藿多糖和黃芪多糖,用硫酸蒽酮法測(cè)定其含量；用酸堿沉淀法提取蜂膠黃酮,用蘆丁法測(cè)定其含量；購(gòu)買(mǎi)市售人參皂甙,用TLC分光光度法測(cè)定其含量。然后按一定比例配制淫-蜂復(fù)方中藥成分免疫增強(qiáng)劑(cCHMI1)和參-芪復(fù)方中藥成分免疫增強(qiáng)劑(cCHMI2)。另取淫羊藿、黃芪和人參煎劑,用101沉淀劑去除雜質(zhì),蜂膠乙醇液精濾,精制成注射液,測(cè)定相應(yīng)中藥成分的含量,配制成與中藥成分復(fù)方含量相同的2個(gè)中

3、藥復(fù)方(cCHM1和cCHM2)。從而為以下試驗(yàn)做好準(zhǔn)備。 試驗(yàn)Ⅱ、中藥成分復(fù)方的安全性測(cè)定 分別用家兔點(diǎn)眼法、家兔股四頭肌注射法和小鼠腹腔注射法測(cè)定了2個(gè)中藥成分復(fù)方的局部刺激性和急性毒性。結(jié)果,2個(gè)中藥成分復(fù)方對(duì)家兔眼結(jié)膜和注射局部肌肉無(wú)任何刺激性。cCHMI1出現(xiàn)中毒反應(yīng)的劑量是臨床應(yīng)用劑量的9.3倍,LD50為211.54±32.37 mg·kg-1;cCHMI2出現(xiàn)中毒反應(yīng)的劑量是臨床應(yīng)用劑量的314.9倍,L

4、D50為8435.29±1379.28 mg·kg-1。表明,2個(gè)中藥成分復(fù)方的安全范圍較寬,按照常規(guī)劑量應(yīng)用是絕對(duì)安全的。 試驗(yàn)Ⅲ、中藥成分復(fù)方免疫增強(qiáng)效果的觀(guān)察 為驗(yàn)證2個(gè)中藥成分復(fù)方的免疫增強(qiáng)作用,以2個(gè)中藥成分復(fù)方為免疫佐劑,分別配合兔瘟滅活苗免疫家兔和配合雞新城疫滅活苗免疫雛雞,測(cè)定兔、雞血清抗體效價(jià)和雛雞外周血T淋巴細(xì)胞增殖的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果表明,2個(gè)中藥成分復(fù)方能顯著提高兔、雞的血清抗體效價(jià),增強(qiáng)雛雞外周血T

5、淋巴細(xì)胞增殖,具有較好的免疫佐劑活性。 試驗(yàn)Ⅳ、中藥成分復(fù)方與相應(yīng)的中藥復(fù)方增強(qiáng)免疫效果的比較 將2個(gè)中藥成分復(fù)方cCHMI1、cCHMI2和2個(gè)相應(yīng)的中藥復(fù)方cCHM1和cCHM2分別與新城疫滅活苗混合制成疫苗免疫雛雞,以油佐劑苗和無(wú)佐劑苗為對(duì)照,分別于免疫后第7、14、21、28、35、42天用MTT法和血凝抑制試驗(yàn)法檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞增殖和血清抗體效價(jià)的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果表明,4個(gè)復(fù)方均能顯著促進(jìn)雛雞淋巴細(xì)胞增殖和提高

6、血清抗體效價(jià),效果與油佐劑苗相當(dāng)；中藥成分復(fù)方稍?xún)?yōu)于中藥復(fù)方,cCHMI1的效果優(yōu)于cCHMI2。 試驗(yàn)Ⅴ、中藥新促孕液及其主要組分藥和相關(guān)單味藥對(duì)全身免疫功能的影響 取間情期新西蘭母兔隨機(jī)分組,分別灌胃新促孕液、主要組分藥淫羊藿、益母草和紅花以及相關(guān)單味藥黃柏、丹參和黃芪煎劑,每日1次,連續(xù)7天,于第8天心臟采血,測(cè)定血常規(guī)、T淋巴細(xì)胞增殖、NK細(xì)胞殺傷力和血清IL-2含量的變化。另對(duì)成年雌性小鼠作同期發(fā)情和配種處理,

7、取分娩小鼠分組,子宮灌注以上各藥,每天1次,連續(xù)4天,于最后一次灌注后次日捕殺,取脾臟檢測(cè)T淋巴細(xì)胞增殖和NK細(xì)胞殺傷力。結(jié)果,新促孕液、淫羊藿、丹參和黃芪能顯著提高兔外周血的T淋巴細(xì)胞增殖、NK細(xì)胞殺傷力和血清IL-2含量,顯著提高小鼠脾臟NK細(xì)胞殺傷力。表明,新促孕液能增強(qiáng)全身免疫功能,其中淫羊藿起主要作用,丹參和黃芪可作為改進(jìn)新促孕液組方的候選藥。 試驗(yàn)Ⅵ、新促孕液及其主要組分藥和相關(guān)單味藥對(duì)局部免疫功能的影響 取

8、成年雌性小鼠隨機(jī)分組,分別灌胃新促孕液、主要組分藥淫羊藿、益母草和紅花以及相關(guān)單味藥黃柏、丹參和黃芪煎劑,每天1次,連續(xù)7天,于第8天處死,切取子宮切片；同時(shí)對(duì)成年雌性小鼠作同期發(fā)情處理、配種,取當(dāng)日分娩小鼠分組,子宮灌注以上各藥,每天1次,連續(xù)4天,于最后一次灌注后次日捕殺,切取子宮切片。用切片測(cè)定子宮局部白細(xì)胞密度、肥大細(xì)胞數(shù)量和iNOS表達(dá)的變化。結(jié)果,新促孕液和淫羊藿,益母草、紅花和丹參煎劑口服可以明顯提高子宮iNOS的表達(dá),丹

9、參還可提高子宮白細(xì)胞密度、肥大細(xì)胞數(shù)量；新促孕液和淫羊藿、丹參和黃芪煎劑子宮灌注可顯著提高子宮白細(xì)胞密度和肥大細(xì)胞數(shù)量。表明,新促孕液可以增強(qiáng)子宮局部免疫功能,淫羊藿和益母草起主要作用,丹參和黃芪可作為改進(jìn)新促孕液組方的候選藥。 試驗(yàn)Ⅶ、新促孕液及其加味方對(duì)全身免疫功能的影響 以新促孕液為基本方,分別加入丹參、黃芪制備兩個(gè)加味方。取成年母兔隨機(jī)分組,分別灌胃新促孕液和兩個(gè)加味方,每天1次,連續(xù)7天,于第8天心臟采血,測(cè)定

10、外周血T淋巴細(xì)胞增殖、NK細(xì)胞活力和血清IL-2含量；同時(shí)取成年母兔子宮灌注病原菌制備子宮內(nèi)膜炎模型,分組分別子宮灌注新促孕液和2個(gè)加味方治療,對(duì)照組灌注生理鹽水,每天1次,連續(xù)7天,于第8天采血檢測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞增殖、NK細(xì)胞殺傷力。結(jié)果,新促孕液可明顯促進(jìn)健康兔和子宮內(nèi)膜炎模型兔的T淋巴細(xì)胞增殖、提高NK細(xì)胞殺傷力,提高健康兔血清IL-2含量,丹參加味方能明顯促進(jìn)健康兔T淋巴細(xì)胞增殖和提高血清IL-2含量。表明,新促孕液和2個(gè)加味

11、方能不程度地提高全身免疫功能,以新促孕液的作用最強(qiáng)。 試驗(yàn)Ⅷ、新促孕液及其加味方對(duì)局部免疫功能的影響 取成年雌性小鼠,同期發(fā)情處理后隨機(jī)分組,分別灌胃新促孕液和2個(gè)加味方,每天1次,連續(xù)7天,于第8天處死小鼠,取子宮切片,檢測(cè)白細(xì)胞密度、肥大細(xì)胞數(shù)量和iNOS的表達(dá)；制備兔子宮內(nèi)膜炎模型,分組分別子宮灌注新促孕液和2個(gè)加味方治療,對(duì)照組灌注生理鹽水,每天1次,連續(xù)7天,于第8天處死,取子宮切片測(cè)定子宮白細(xì)胞密度,勻漿測(cè)定