新的抑癌microRNA miR-520e的發(fā)現(xiàn)及其在肝癌中作用分子機(jī)制的研究.pdf

1、肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)慢性感染與肝癌的發(fā)生發(fā)展具有十分密切的關(guān)系，乙肝病毒表達(dá)的X蛋白(hepatitis B virus Xprotein，HBx)具有重要的致癌作用。MicroRNAs(miRNAs)是一類長(zhǎng)度為19～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，廣泛存在于真核生物中，可作為癌基因或抑癌基因參

2、與腫瘤的病理過(guò)程，是當(dāng)前國(guó)際研究的熱點(diǎn)。本論文首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了在肝癌細(xì)胞中miRNA-520e(miR-520e)是一個(gè)新的抑癌microRNA，從以下三個(gè)方面對(duì)其進(jìn)行了深入系統(tǒng)的研究，主要研究結(jié)果如下：
　　 第一部分：miR-520e對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用
　　 為了觀察miR-520e與肝癌的關(guān)系，首先檢測(cè)了miR-520e在肝癌細(xì)胞和臨床肝癌組織中的表達(dá)情況。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，與正常肝細(xì)胞(L-O2和Chan

3、gliver)相比，miR-520e在肝癌細(xì)胞系(HepG2、H7402和MHCC-97L)中明顯低表達(dá)。同時(shí)，miR-520e在23例臨床肝癌組織中的表達(dá)水平顯著低于其癌旁肝組織。上述結(jié)果提示，miR-520e是一個(gè)潛在的抑癌miRNA。然后，我們對(duì)miR-520e下調(diào)的分子機(jī)制進(jìn)行了研究。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，在miR-520e DNA的上游調(diào)控區(qū)存在一個(gè)CpG島。應(yīng)用甲基化特異性PCR和亞硫酸鹽測(cè)序PCR的方法證實(shí)，在肝癌細(xì)胞和

4、肝癌組織中miR-520e上游調(diào)控區(qū)CpG島存在超甲基化現(xiàn)象。進(jìn)一步利用雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-520e的CpG島區(qū)具有啟動(dòng)子活性。因此，miR-520e DNA超甲基化是導(dǎo)致miR-520e表達(dá)下調(diào)的原因之一。然后，我們對(duì)miR-520e與肝癌細(xì)胞增殖的關(guān)系進(jìn)行了探討。應(yīng)用MTT檢測(cè)、EdU摻入增殖分析和克隆形成等實(shí)驗(yàn)方法，發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-520e和在正常肝細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-520e抑制劑后，miR-520e具有抑制

5、肝癌細(xì)胞增殖的作用；裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-520e后肝癌細(xì)胞HepG2的成瘤能力明顯下降；為了探討miR-520e是否具有潛在的治療作用，采用在接種肝癌細(xì)胞HepG2的荷瘤裸鼠的腫瘤組織內(nèi)直接注射的方法，發(fā)現(xiàn)miR-520e可明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)，表明miR-520e在肝癌治療中有潛在的應(yīng)用價(jià)值。上述結(jié)果表明，miR-520e是一個(gè)新的抑癌miRNA。
　　 第二部分：miR-520e抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)作用的分子機(jī)制

6、r>　　 通常miRNA通過(guò)其靶基因?qū)崿F(xiàn)功能，為了闡明miR-520e抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)作用的分子機(jī)制，我們對(duì)miR-520e的靶基因進(jìn)行了探討。運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)，核因子κB誘導(dǎo)激酶(NF-κB-inducing kinase，NIK)；是miR-520e的一個(gè)潛在靶基因。利用雙熒光報(bào)告基因、RT-PCR、real-time PCR和免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-520e可以直接靶向NIK的3UTR區(qū)域，從而抑制其翻譯。研究發(fā)現(xiàn)，

7、NIK在肝癌細(xì)胞系(HepG2，H7402和MHCC-97L)中和23例臨床肝癌組織中呈高表達(dá)，并且與miR-520e的表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)，提示miR-520e可能通過(guò)其靶基因NIK發(fā)揮抑癌作用。研究發(fā)現(xiàn)，在肝細(xì)胞Chang liver中同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-520e抑制劑和NIK的siRNA時(shí)，NIK siRNA可以逆轉(zhuǎn)miR-520e抑制劑導(dǎo)致的促進(jìn)肝細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，支持了miR-520e可通過(guò)靶向NIK發(fā)揮抑制肝細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。進(jìn)一步研究

8、表明，在肝癌細(xì)胞中NIK激活ERK1/2進(jìn)而促進(jìn)NF-κB的轉(zhuǎn)錄和入核。因此，miR-520e可通過(guò)抑制NIK-ERK1/2-NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮抑癌功能。
　　 第三部分：miR-520e在HBx促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖中的作用
　　 為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-520e具有抑癌作用，我們觀察了miR-520e在HBx致癌中的變化和意義。利用qRT-PCR方法發(fā)現(xiàn)，miR-520e在穩(wěn)定表達(dá)HBx的肝癌細(xì)胞系HepG2-X和穩(wěn)

9、定表達(dá)HBx肝細(xì)胞系L-O2-X中均呈下調(diào)表達(dá)。應(yīng)用RNA干擾沉默HBx mRNA的表達(dá)，可導(dǎo)致miR-520e的表達(dá)水平上調(diào)，提示miR-520e參與了HBx的促肝癌細(xì)胞增殖作用。應(yīng)用MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在HepG2-X肝癌細(xì)胞系和L-O2-X肝細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)miR-520e，可阻斷HBx的促肝癌細(xì)胞增殖的作用。應(yīng)用生物信息學(xué)方法進(jìn)行分析，結(jié)果顯示絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶2(mitogen-activated protein kinas

10、e kinase kinase2，MEKK2)miR-520e的一個(gè)潛在的靶基因。雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果表明，miR-520e可以直接靶向MEKK2的3'UTR區(qū)域。RT-PCR和免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-520e可以顯著抑制MEKK2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)一步證實(shí)了MEKK2是miR-520e的直接靶基因。為了進(jìn)一步探討MEKK2是否參與miR-520e對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用，在轉(zhuǎn)染miR-520e抑制劑的肝癌細(xì)胞中干擾

11、MEKK2，發(fā)現(xiàn)MEKK2可明顯阻斷miR-520e抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用。上述結(jié)果表明，HBx通過(guò)抑制miR-520e促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，miR-520e通過(guò)其靶向MEKK2發(fā)揮作用。
　　 綜上所述，本研究首次報(bào)道m(xù)iRNA-520e是一個(gè)新的抑癌miRNA，通過(guò)其靶基因NIK抑制肝癌的增殖作用；miRNA-520e通過(guò)其靶基因MEKK2參與了HBx的致癌過(guò)程，進(jìn)一步豐富了HBx致癌的分子機(jī)制研究。miRNA-520e抑制肝