miR-21在胃癌發(fā)生及進展中作用的分子機制研究.pdf

1、本研究分為三部分： 第一部分：miR-21在胃癌、胃癌細胞株、H.pylori感染者及正常人胃粘膜中的表達 目的：研究胃癌組織、胃癌細胞株及H.pylori感染者胃粘膜miR-21的表達水平，評價其與胃癌及H.pylori感染的相關性。 方法：胃癌手術組織標本10例，采集自上海仁濟醫(yī)院消化科病理室，并由病理醫(yī)生獨立做出診斷12例H.pylori感染胃粘膜組織標本及8例正常胃粘膜組織標本均采集自上海仁濟醫(yī)院胃鏡室，

2、并經快速尿素酶試驗及病理醫(yī)生根據鏡下組織學表現判定H.pylori感染及炎癥分級。人類胃癌細胞株AGS、MKN45、MKN28、SGC7901及非胃癌細胞株GES-1作為細胞株標本用于本研究。應用特異性stem-loop引物完成逆轉錄，并同時采用靈敏的TaqmanrealtimePCR技術檢測以上標本的miR-21表達水平。結果采用2-△ΔCt方法計算不同組織及細胞間表達水平差異。應用SPSS13.0軟件進行數據分析，統(tǒng)計方法采用非配對

3、2組資料間t檢驗來判定顯著性差異，以p＜0.05作為判定標準。 結果：胃癌組織miR-21表達水平明顯高于正常胃粘膜組織(p＜0.01;平均18.25倍)；胃癌細胞株AGS、MKN45、MKN28、SGC7901的miR-21表達水平也明顯高于非胃癌細胞株GES-1及正常胃粘膜組織(p＜0.01;平均9.2倍)；H.pylori感染胃粘膜組織中miR-21表達水平較正常胃粘膜組織明顯升高(p＜0.05，平均2倍)。 結論

4、:miR-21在胃癌組織、胃癌細胞株及H.pylori感染者胃粘膜組織中的表達水平較正常胃粘膜組織明顯升高，提示miR-21的異常表達水平與胃癌發(fā)生存在緊密聯(lián)系；同時，從H。pylori感染到胃癌組織間miR-21表達水平呈梯度升高趨勢，說明H.pylori感染可能是引起miR-21表達紊亂的始動因素，后者可能是引起胃癌發(fā)生的重要分子機制。 第二部分：miR-21對AGS細胞功能的影響 目的：評價miR-21的異常表達對

5、AGS細胞功能的影響，包括凋亡、增殖及細胞侵襲，闡明miR-21在腫瘤發(fā)生全過程中的可能作用。 方法：應用gain-andloss-offunction實驗方法來驗證miR-21表達水平變化對AGS細胞功能的影響。首先將miR-21前體(pre-miR-21)序列克隆至mscv-puro工具載體上，并轉染至AGS細胞內，使miR-21表達水平升高；相反，通過轉染人工合成的特異性miR-21抑制劑(inhibitor)來降低AGS

6、細胞內miR-21表達水平。應用流式細胞技術及細胞活力計數方法來檢測AGS細胞的凋亡及增殖功能變化，并通過transwellassay及細胞劃痕試驗檢測細胞侵襲轉移能力改變。數據結果采用SPSS13.0進行統(tǒng)計分析，采用二樣本t檢驗判定2組間的顯著性差異，以p＜0.05作為顯著性判定標準。 結果：轉染pre-miR-21質粒及特異性miR-21inhibitor可以有效地升高或降低AGS細胞內miR-21表達水平(p＜0.01，

7、升高或降低＞4倍);miR-21表達水平降低可誘發(fā)AGS細胞凋亡率明顯增加(p＜0.05，凋亡增加13.6倍)，提示miR-21在胃癌中可作為一種抗凋亡分子發(fā)揮作用；miR-21過表達可促進AGS細胞增殖，較對照組明顯加快(p＜0.05，增加24.7％)，同時，miR-21表達水平降低可減慢AGS細胞增殖(p＜0.05，降低21.8％)；此外，AGS細胞在轉染miR-21inhibitor后，細胞侵襲及轉移能力均出現明顯的下降，較對照組

8、有明顯的差異(p＜0.05)； 結論：miR-21表達紊亂可以誘發(fā)胃癌細胞發(fā)生多種生物學功能改變，包括可以抑制細胞凋亡并促進細胞增殖，同時可以影響細胞侵襲轉移。說明miR-21在胃癌的發(fā)生和發(fā)展全過程中都發(fā)揮作用。另一方面，我們發(fā)現細胞內miR-21表達水平可通過外源性手段有效調控，提示針對miRNA表達水平的有效干預可以調控腫瘤細胞的生物學功能，有望成為腫瘤治療一個新的方向。 第三部分：miR-21調控靶基因RECK表

9、達以及與細胞侵襲轉移的相互作用 目的：驗證RECK是miR-21重要的靶基因，闡述miR-21可能通過對RECK的調控來影響AGS細胞的侵襲轉移功能。 方法：借助目前常用的miRNA靶基因數據庫對miR-21的靶基因進行預測和篩選，通過TaqmanrealtimePCR、westernblot及Luciferasereporterassay方法進行驗證。 結果：通過應用miRNA靶基因數據庫進行預測，RECK可能

10、是miR-21的一個靶基因。并且利用RT-PCR或westernblot檢測手段，結果發(fā)現均RECK與miR-21表達在胃癌組織與正常組織間均呈負性相關；同時，轉染miR-21inhibitor的AGS細胞RECK蛋白表達水平升高，較轉染pre-miR-21質粒AGS細胞及陰性參照間有明顯差異(p＜0.05)；Luciferasereporterassay結果進一步證明RECK是miR-21重要的靶基因。 結論：RECK是miR