耐受性樹突狀細胞對免疫介導性再生障礙性貧血小鼠骨髓造血功能的影響.pdf

1、目的：篩選耐受性樹突狀細胞(tolerogenic dendritic cells，tDCs)的體外培養(yǎng)方法，探索其對免疫介導性再生障礙性貧血模型小鼠造血功能的影響，為tDCs治療再生障礙性貧血的臨床應用提供理論依據(jù)。 方法：采用雌性Balb/c小鼠為供體，雌性昆明小鼠為受體。取供體小鼠骨髓細胞，分離單個核細胞。在含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中加入不同因子組合分為五組進行體外誘導培養(yǎng)：空白組(不加任何因子)、常規(guī)D

2、Cs組(GM—CSF100ng/ml+IL-4100ng/ml)、VD1-DCs 組(GM-CSF20ng/ml+VIP40ng/ml+DXM10ng/ml)、VD2-DCs組(GM-CSF20ng/ml+VIP40ng/ml+DXM50ng/ml)、VD3-DCs組(GM-CSF20ng/ml+VIP40ng/ml+DXM100ng/ml)。光鏡下動態(tài)觀察細胞形態(tài)，流式細胞術(shù)檢測細胞CD80、CD86、CD40、CD11c表達，MTT

3、法檢測DCs刺激淋巴細胞增殖活性。40只受體小鼠分為正常對照組、模型組、tDCs組、單純照射組。模型組：昆明小鼠經(jīng)X射線亞致死量(7Gy)全身均勻照射后，于4小時內(nèi)自尾靜脈輸入Balb/c小鼠的胸腺淋巴結(jié)細胞1X106只。tDCs組：制模后第3天、第5天分別輸注tDCs1×106/只。動態(tài)觀察小鼠外周血白細胞變化，小鼠瀕死時(或制模后第28天)，取股骨行骨髓病理切片觀察，計數(shù)單側(cè)骨髓有核細胞數(shù)，甲基纖維素半固體培養(yǎng)法測定CFU-GM集落

4、數(shù)，流式細胞術(shù)檢測小鼠脾淋巴細胞CD8+T細胞、CD4+CD25+T細胞的表達。 結(jié)果： 1、利用GM-CSF、IL-4、VIP、DXM、LPS等因子體外培養(yǎng)能誘導生成具有典型樹枝狀突起的DCs。常規(guī)DCs組、VD1-DCs組、VD2-DCs組、VD3-DCs組CD11c的表達較高，與空白組比較有顯著性差異(P＜0.05)。 2、VD1-DCs組、VD2-DCs組、VD3-DCs組CD40、CD80、CD86表達

5、和淋巴細胞增殖活性均低于常規(guī)DCs組(P＜0.05)，其中VD1-DCs組(VIP濃度為40ng/ml、DXM為10ng/ml)最低，差異最明顯。 3、再生障礙性貧血模型組小鼠外周血白細胞數(shù)持續(xù)下降，制模后第28天生存率10％，單側(cè)股骨骨髓有核細胞數(shù)及CFU-GM集落數(shù)明顯減少，與tDCs組、單純照射組相比有明顯差異(P＜0.05)。骨髓病理切片顯示：骨髓增生極度低下，造血細胞極度減少，大量脂肪細胞填充骨髓腔。脾淋巴細胞CD8+

6、T細胞的表達明顯升高，CD4+CD25+T細胞的表達明顯降低，與tDCs組、正常對照組相比有明顯差異(P＜0.05)。 4、tDCs組小鼠在制模后白細胞數(shù)有所下降，第10天下降至低點(1.52×109/L)，此后逐漸恢復至正常。制模后第28天生存率70％。tDCs組單側(cè)股骨骨髓有核細胞數(shù)及CFU-GM集落數(shù)與正常對照組、單純照射組無明顯差異(P＞0.05)，與模型組比較差異明顯(P＜0.05)。骨髓病理切片示骨髓增生活躍，脂肪細

7、胞較少，與正常對照組相似。tDCs組小鼠脾淋巴細胞CD4+CD25+T細胞的表達明顯升高，與模型組比較有明顯差異(P＜0.05)。 結(jié)論： 1.小鼠骨髓單個核細胞，體外經(jīng)GM-CSF、VIP、DXM、LPS聯(lián)合誘導培養(yǎng)生成耐受性樹突狀細胞(tDCs)，其中VIP40ng/ml聯(lián)合DXM10ng/ml的培養(yǎng)條件最佳。 2.小鼠經(jīng)X射線7Gy全身均勻照射后，于4小時內(nèi)自尾靜脈輸入供體小鼠的胸腺淋巴結(jié)細胞1×106/只