誘餌寡核苷酸調(diào)節(jié)miR223的功能研究.pdf

1、背景：MicroRNAs(miRNA)是一類參與細胞發(fā)育、細胞分化、細胞凋亡、細胞增殖以及腫瘤發(fā)生的調(diào)節(jié)分子家族。miRNA與其靶mRNA在RISC中產(chǎn)生相互作用。miRNA與mRNA3'端非翻譯區(qū)(3'UTR)的堿基配對方式是序列特異性的，因此與成熟miRNA有互補序列的寡核苷酸鏈也具有miRNA轉(zhuǎn)錄剪切和表達沉默的功能。miRNA可以通過序列匹配作用于眾多的靶mRNA分子，干擾他們的穩(wěn)定性及相關(guān)的蛋白翻譯。因此，一個重要miRNA功

2、能缺失，將導致大量靶mRNA改變，進而影響細胞功能乃至機體整體的調(diào)節(jié)平衡。已有文獻報道m(xù)RNA的3'UTR可以通過堿基配對的方式來調(diào)節(jié)細胞質(zhì)中的miRNA的活動，因此，具有與靶mRNAYUTR相似序列的寡核苷酸鏈也可作為誘餌寡核苷酸，競爭性的與相應(yīng)的成熟miRNA結(jié)合。由此可以預測，誘餌RNA分子能夠作為外源競爭RNA(cRNA)靶向作用于成熟miRNA，并選擇性的保護相應(yīng)的mRNAs。
　　目的：我們通過系統(tǒng)的研究來評估合成的誘

3、餌寡核苷酸對hsa-mir-223活動的選擇性靶向作用，并將包含與成熟miR-223及靶mRNA3'UTR序列堿基配對位點的誘餌寡核苷酸用于檢測對miR-223活性的反向作用。
　　方法：根據(jù)成熟miR-22序列及其靶mRNA序列，利用在線演算法分析，設(shè)計并合成寡核苷酸誘餌。利用雙熒光素酶試驗通過分別包含IGF1R，F(xiàn)OXO1，POLR3G，F(xiàn)OXO3，CDC27，F(xiàn)BXW7及PAXIP1等靶mRNA3'端非編碼區(qū)(即3'UTR)

4、的熒光素酶報告質(zhì)粒中熒光素酶活性的變化來評估合成寡核苷酸誘餌對hsa-mir-223活性的影響。分別利用實時定量PCR與蛋白印跡用來測量誘餌寡核苷酸對miR-223靶向mRNA的表達水平的影響。利用CCK-8，MTT，酸性磷酸酶活性測定，集落形成實驗，腫瘤細胞粘附到膠原的實驗以及Hoechst染色等分別用于檢測寡核苷酸誘餌對miR-223參與的細胞生長、增殖、粘附及凋亡等生物功能的影響。
　　結(jié)果：除了與成熟miR-223全長互補

5、的反義寡核苷酸，分別與成熟miR-2235'端，3'端或中間序列互補的誘餌寡核苷酸均抑制miR-223對IGF1R，F(xiàn)OXO1，F(xiàn)OXO3，CDC27，POLR3G，F(xiàn)BXW7等靶mRNA3'UTR的作用，并不同程度的挽救了miR-223所抑制的上述靶mRNA在mRNA和蛋白表達水平。因為PAXIP1不是miR-223的靶點，所以所有誘餌寡核苷酸對其均沒有影響?；贗GF1R3'UTR所設(shè)計的誘餌寡核苷酸1是除外與成熟miR-223全長

6、互補的反義寡核苷酸誘餌4，恢復IGF1R表達最明顯的寡核苷酸誘餌。對于具有與IGF1R3'UTR類似的與miR-223結(jié)合位點的FOXO3和POLR3G，誘餌1也表現(xiàn)出了顯著的挽救效應(yīng);而誘餌1未能恢復Sp1，CDC27和FBXW7的表達。
　　結(jié)論：本研究實驗數(shù)據(jù)表明具有特異性序列的誘餌寡核苷酸可以作為競爭性外源RNA選擇性的抑制miRNA對靶mRNA的作用。篩選并鑒別對miRNA靶向作用具有選擇性抑制作用的誘餌寡核苷酸對未來臨