戊型肝炎病毒寡核苷酸檢測芯片的初步研究.pdf

1、戊型肝炎(hepatitis E,HE)是由HE病毒(hepatitis E virus,HEV)引起的一種經(jīng)糞口途徑傳播的急性傳染病,呈全球分布,是世界各地尤其發(fā)展中國家主要的健康問題之一,成為了繼甲型肝炎外另一種經(jīng)腸道傳播的嚴(yán)重危害人類健康的病毒性肝炎,給社會(huì)帶來了很大的危害。
　　 根據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生部27種法定報(bào)告?zhèn)魅静∫咔閳?bào)告統(tǒng)計(jì),HE發(fā)病率高,死亡率高,呈逐年上升趨勢。近年來發(fā)現(xiàn)在豬等動(dòng)物中也有廣泛的HEV感染,

2、使該病成為一種人畜共患病。目前,HE已被世界重視,世界衛(wèi)生組織將其認(rèn)定是發(fā)展中國家的一個(gè)重要公共衛(wèi)生問題。
　　 目前HE的檢測方法主要有免疫電鏡技術(shù)(IEM)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和原位雜交。但HEV感染窗口期、患者自身免疫系統(tǒng)以及檢測方法等多方面因?yàn)榻o戊肝的診斷帶來了難度。因而有必要尋找一種高效、高通量和快速的HEV檢測方法。
　　 基因芯片技術(shù)是上世紀(jì)90年代興起,源于計(jì)算機(jī)集成化

3、芯片理念的一門新技術(shù)。實(shí)質(zhì)就是利用Southern blot原理,在固相支持物的表面原位合成寡核苷酸探針,或者直接將大量DNA探針以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面,這些被固定在基質(zhì)的探針上就形成了高密度DNA微陣列。樣品DNA或RNA經(jīng)過熒光標(biāo)記,與陣列上的探針進(jìn)行雜交反應(yīng),按照堿基互補(bǔ)配對原則,探針特異性地結(jié)合相應(yīng)被熒光標(biāo)記的分子。通過對雜交信號的檢測分析,得出樣品的基因序列及其表達(dá)的信息,從而對基因序列及功能進(jìn)行大規(guī)模、高通量

4、、平行的研究。
　　 近幾年基因芯片技術(shù)越來越多的被應(yīng)用于病原體的診斷,如用基因芯片檢測痘苗病毒、皰疹病毒以及乙型肝炎病毒,但是關(guān)于基因芯片在戊型肝炎病毒方面的檢測還未見諸文獻(xiàn)。因此,本文立足于制備戊型肝炎病毒的檢測芯片,初步探討該方法的可行性,為進(jìn)一步將基因芯片技術(shù)應(yīng)用于各型肝炎病毒的檢測建立一個(gè)技術(shù)平臺。
　　 本課題分為兩個(gè)部分,具體研究結(jié)果如下:
　　 一.探針的設(shè)計(jì)與芯片的雜交
　　 首先對戊型

5、肝炎寡核苷酸芯片進(jìn)行了探針設(shè)計(jì)以及芯片的雜交。根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫中的全基因組序列信息,利用美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)提供的BLAST分析軟件,找出HEV的保守序列,采用生物學(xué)軟件oligo6.0設(shè)計(jì)60 mer寡核苷酸探針,并對其進(jìn)行BLAST比對,采用了嚴(yán)格的遴選標(biāo)準(zhǔn)(為了保證設(shè)計(jì)的探針具有高度的特異性和靈敏度,設(shè)計(jì)時(shí)遵循以下原則:使探針Tm值在85±5℃之間,GC含量介于40％-60％,重復(fù)的單一堿基連續(xù)不超過5個(gè)

6、,探針分子最穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)配對堿基長度少于6bp,且探針內(nèi)部發(fā)夾結(jié)構(gòu)不超過5個(gè)。在BLAST比對中,與其它基因的同源性小于70％,連續(xù)相同堿基的數(shù)量不超過18個(gè)),從中篩選出特異性高的24條作為檢測用探針。寡核苷酸探針合成和純化后,用芯片打印儀固定在玻片上。
　　 運(yùn)用限制性顯示(RD)技術(shù),用Cy3標(biāo)記的通用引物標(biāo)記質(zhì)粒樣品,首先以Sau3AI對DNA或cDNA樣品進(jìn)行限制性酶切,得到許多大小適合的限制性酶切片段,繼而在片段兩端

7、加上合適的接頭,再利用帶有熒光標(biāo)記的通用引物Cy3-U1進(jìn)行樣品標(biāo)記,然后與芯片進(jìn)行雜交。雜交后清洗玻片并干燥,以Genepix4110B對芯片進(jìn)行掃描,分析各探針的雜交信號強(qiáng)弱并結(jié)合GenePix Pro 6.0軟件來對結(jié)果進(jìn)行分析。
　　 二.芯片的優(yōu)化與臨床樣品的檢測
　　 其次,進(jìn)行了芯片的優(yōu)化以及臨床樣品的檢測。為了提高芯片的特異性和靈敏度,我們對探針濃度、片基的放置時(shí)間、樣品濃度等雜交條件進(jìn)行了初步研究。

8、r>　　 結(jié)果表明,探針濃度在0.5,1,2,3μg/μL四種濃度下和熒光標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交,在同等的雜交環(huán)境和芯片掃描參數(shù)條件下,四組探針信號強(qiáng)度之間存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,表現(xiàn)為0.5與1μg/μL濃度之間的差異具有顯著性,而探針濃度1與2μg/μL,1與3μg/μL,2與3μg/μL之間則無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí),片基的放置時(shí)間對芯片的雜交結(jié)果也有一定影響,制備芯片上的探針熒光信號在30天和60天放置后沒有明顯的熒光信號衰減差異,

9、但是放置90天后芯片上的探針顯示出了一些局部信號的減弱。其次,從樣品濃度的分析結(jié)果來看,在106-1011copy/mL之間的樣品濃度線性程度較好(r=0.9913)。因此,通過實(shí)驗(yàn),我們認(rèn)為樣品濃度在105copy/mL為稀釋的最低濃度水平,在實(shí)驗(yàn)取樣時(shí)的樣品濃度不應(yīng)低于此水平。
　　 在通過芯片的初步篩選后,確定了11條探針,并將制備的戊型肝炎寡核苷酸基因芯片初步應(yīng)用于小規(guī)模的臨床樣品檢測。由廣州市傳染病醫(yī)院提供9例臨床樣品

10、(5例臨床初篩陽性患者血清樣品,3例臨床排除及1例正常人血清樣品),采用戊型肝炎寡核苷酸基因芯片對樣品分別予以實(shí)驗(yàn)檢測,同時(shí)運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)對芯片的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行平行檢測。
　　 其方法是,從臨床樣品的血清中抽提出病毒RNA,逆轉(zhuǎn)錄后用RD標(biāo)記使樣品標(biāo)上熒光物質(zhì),然后與篩選出來的11條高靈敏度高特異性的HEV寡核苷酸探針、1條陽性對照探針、1條陰性探針以及1條空白探針進(jìn)行雜交,芯片洗脫,掃描后采用GenePix P

11、ro 6.0軟件進(jìn)行結(jié)果分析。同時(shí)實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用RT-PCR的方法分別針對不同基因型的戊型肝炎病毒進(jìn)行鑒定,并與芯片檢測的結(jié)果相對照。雜交結(jié)果表明,芯片的特異性和靈敏度較高,陰性對照和陽性對照在芯片上均發(fā)揮著較為可靠的檢測功能。同時(shí),基因芯片的結(jié)果避免了假陽性和假陰性和窗口期結(jié)果無法檢測等因素的影響,為戊型肝炎的早期診斷提供了一種較為有效的檢測手段。
　　 綜上所述,本研究自行設(shè)計(jì)制備了戊型肝炎寡核苷酸芯片,并用于實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化和臨