海馬腦片氧糖剝奪模型中KCC2-GABAA受體通路對丙泊酚后處理腦保護(hù)作用的調(diào)控.pdf

1、目的:臨床工作中神經(jīng)外科手術(shù)、腦動脈瘤切除術(shù)以及心跳驟停等可導(dǎo)致腦缺血再灌注損傷，患者的生存質(zhì)量受到嚴(yán)重影響。對于腦缺血高?；颊?，如何合理有效的選擇麻醉藥物是需要麻醉醫(yī)生慎重思考的問題。丙泊酚是臨床常用的靜脈麻醉藥。能夠降低腦氧代謝率、顱內(nèi)壓，且具有抗氧化和抑制細(xì)胞凋亡的作用，從而能夠減輕腦缺血再灌注損傷。課題組前期研究工作發(fā)現(xiàn)，丙泊酚后處理對缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制與興奮性谷氨酸受體(α-amino-3-hydroxy-

2、5-methyl-4-isoxazole-propionic acid receptor,AMPAR)受體有關(guān)。近年來，越來越多的學(xué)者認(rèn)同缺血再灌注損傷以及氧糖剝奪(Oxygen andGlucose Deprivation，OGD)引起的損傷為興奮性毒性損傷，是機(jī)體興奮-抑制平衡被打破造成。GABAA受體作為成熟哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的抑制性受體，鉀氯共轉(zhuǎn)運(yùn)體（K+-Cl-cotransporter，KCC2）是保證GABAA受體介

3、導(dǎo)抑制性突觸后傳遞的重要前提條件，但該通路是否參與了丙泊酚后處理的腦保護(hù)機(jī)制尚不清楚。本研究旨在探討在離體海馬腦片氧糖剝奪損傷中，丙泊酚后處理是否對具有保護(hù)作用，并進(jìn)一步探討KCC2-GABAA受體通路調(diào)控機(jī)制，從而為臨床上圍手術(shù)期腦缺血人群麻醉藥物的合理選擇提供理論依據(jù)。
　　方法:本課題采用離體海馬腦片建立氧糖剝奪、復(fù)糖復(fù)氧模型，模擬在體缺血再灌注損傷。實(shí)驗(yàn)主要分三部分進(jìn)行，第一部分，探討丙泊酚后處理對氧糖剝奪海馬腦片的保護(hù)作

4、用。首先建立氧糖剝奪模型，篩選合適的氧糖剝奪時間。選取7min，10min，12min，15min作為氧糖剝奪處理時間，分別記做O1-O4組，處理相應(yīng)時間后復(fù)糖復(fù)氧孵育1h。采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)誘發(fā)記錄動作電位(AP)，以評價(jià)不同時程OGD對CA1區(qū)錐體神經(jīng)元興奮性的影響。然后取54張海馬腦片，采用隨機(jī)數(shù)字表法，將其分為3組(n=12):對照組（C組）置于正常人工腦脊液中培養(yǎng)7 min+1 h;OGD組置于持續(xù)通以95％N2的無糖人工腦

5、脊液中孵育7 min，然后放入正常人工腦脊液中孵育1 h;丙泊酚后處理組（P組）給予OGD7 min后轉(zhuǎn)入含丙泊酚濃度為1.2μg/ml的人工腦脊液中孵育1h。采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄自發(fā)興奮性突觸后電流(spontaneous Excitatory Postsynaptic Currents，sEPSC，sEPSC)和自發(fā)抑制性突觸后電流(spontaneousInhibitory Postsynaptic Currents，sIPS

6、C)的幅值和頻率，探討丙泊酚后處理對海馬OGD后CA1區(qū)神經(jīng)元突觸傳遞的影響。碘化丙啶染色比較各組之間腦片的損傷程度。第二部分，探討GABAA受體在丙泊酚后處理中的作用。72張腦片隨機(jī)分為四組(n=18):對照組C組、OGD組、丙泊酚后處理組P組，GABAA受體抑制劑組P+Bic組。采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元中GABAA受體介導(dǎo)的微小抑制性突觸后電流(mininature Inhibitory Postsynapti

7、cCurrent，mIP SC)幅值及頻率的變化，碘化丙啶染色評價(jià)海馬CA1區(qū)細(xì)胞損傷情況，以及氯離子染色測定CA1區(qū)錐體神經(jīng)元內(nèi)氯離子濃度的改變。第三部分，加入KCC2激動劑NEM，主要分為六組:對照組C組、OGD組、丙泊酚后處理組P組，C+NEM組、OGD+NEM組P+NEM組(n=24)，以研究KCC2-GABAA受體在丙泊酚后處理腦保護(hù)中的調(diào)控作用。采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄mIPSC，離子染色測定CA1區(qū)錐體神經(jīng)元內(nèi)氯離子濃度的

8、改變，Western Blots法測定KCC2在海馬細(xì)胞的表達(dá)情況，RT-PCR法測定KCC2在海馬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的改變。
　　結(jié)果:第一部分:在探索OGD模型適宜時間過程中，與C1組比較，僅O1組誘發(fā)動作電位的頻率降低(P＜0.05)，O2和O3組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);而與O1組比較，O2、O3組頻率升高(P＜0.05)，可能是由于OGD造成的膜電位改變更接近于鈉離子平衡電位，損傷較為嚴(yán)重。故選取7min作為OGD時間

9、。與Con組相比，OGD組和Pro+OGD組sEPSC的幅值和頻率升高，sIPSC的幅值和頻率降低，熒光強(qiáng)度增加，細(xì)胞凋亡增多(P＜0.05);與OGD組比較，Pro+OGD組sEPSC的幅值和頻率降低， sIPSC的幅值和頻率相對升高細(xì)胞凋亡減少(P＜0.05)。
　　第二部分:與C組比較，其余三組mIPSC幅值和頻率均降低，PI熒光強(qiáng)度增加，細(xì)胞凋亡增多，細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度升高(P＜0.05);與OGD組比較，P組mIPSC幅值

10、和頻率均升高，PI熒光強(qiáng)度降低，細(xì)胞凋亡減少，細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度降低(P＜0.05); P+Bic組與OGD組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　第三部分:與C組相比，OGD組、P組mIPSC幅值和頻率均降低，細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度升高，KCC2表達(dá)水平均降低(P＜0.05);與OGD組相比，P組mIPSC幅值和頻率升高，細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度降低，KCC2表達(dá)水平升高(P＜0.05);各組分別加入KCC2激動劑NEM后仍保持上述趨勢。