人尿源性干細胞的分離培養(yǎng)及向神經(jīng)細胞定向分化的體內(nèi)外實驗研究.pdf

1、研究背景及研究目的:
　　中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的治療一直是世界性難題，通過移植干細胞替代受損神經(jīng)細胞繼而重建神經(jīng)功能的治療方法越來越受到重視。研究表明移植神經(jīng)干細胞(Neural Stem Cells，NSCs)治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷均具有一定療效，但是NSCs來源有限、分離和培養(yǎng)均相當(dāng)困難，移植NSCs又存在醫(yī)學(xué)倫理限制、免疫排斥和存活率低等問題。而間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)來源廣泛、分離培

2、養(yǎng)技術(shù)成熟、無倫理限制和低免疫原性，但MSCs的獲取手段多為有創(chuàng)的。
　　人尿源性干細胞(human urine-derived stem cells，hUSCs)是從尿液中分離出的多能干細胞，來源不受局限且安全無創(chuàng)，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景?，F(xiàn)階段國內(nèi)外對其研究甚少，目前研究證實hUSCs具有MSCs的類似特性:表達類似的膜表面標(biāo)志物及具有分化為成骨細胞、軟骨細胞、平滑肌細胞和脂肪細胞的潛能。然而目前尚未見hUSCs向神經(jīng)細胞定向

3、分化的相關(guān)報道，本實驗旨在體外分離培養(yǎng)hUSCs，觀察其生物學(xué)特性，并于體外和體內(nèi)鑒定其向神經(jīng)細胞分化的能力，為將來利用干細胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷疾病尋找新的“種子細胞”來源。
　　方法:
　　1、建立體外分離培養(yǎng)hUSCs的技術(shù)并觀察其生物學(xué)特性
　　1.1利用LMM101培養(yǎng)基貼壁篩選法分離培養(yǎng)hUSCs;
　　1.2 MTT法觀察細胞增殖能力;
　　1.3流式細胞術(shù)檢測表面抗原CD29、CD90、

4、CD44、CD45、CD34、CD73和CD133等的表達情況;
　　1.4采用成脂和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別對hUSCs進行體外誘導(dǎo)，并采用油紅O和茜素紅染色進行鑒定;
　　2、體外誘導(dǎo)hUSCs向神經(jīng)細胞定向分化
　　采用成神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基對hUSCs進行神經(jīng)定向誘導(dǎo)，實時定量熒光PCR(q-PCR)檢測Nestin、Sox2、GFAP、β-tubulinⅢ、NSE和MAP2 mRNA的表達變化，細胞免疫熒光染色檢測Nes

5、tin、Sox2的表達情況。
　　3、體內(nèi)移植GFP-hUSCs，觀察hUSCs在大鼠腦內(nèi)增殖分化情況
　　利用水凝膠負載GFP-hUSCs移植到大鼠模型的腦損傷區(qū)，熒光顯微鏡下觀察腦內(nèi)GFP表達陽性細胞的分布情況，細胞免疫熒光染色檢測Nestin、GFAP和β-tubulinⅢ的表達情況。
　　結(jié)果:
　　1、成功建立了從人新鮮尿液中分離培養(yǎng)hUSCs的技術(shù)
　　hUSCs細胞于接種后3-7 d開始貼壁，

6、7-10d細胞呈集落生長，10-15 d不同細胞克隆呈現(xiàn)4種不同形態(tài):“鋪路石”上皮細胞樣、長梭形肌細胞樣、扁圓形內(nèi)皮細胞樣和短梭形成纖維細胞樣，經(jīng)過2-3周的傳代培養(yǎng)后P4代細胞形態(tài)呈較為均一的成纖維細胞樣，細胞傳至P10余代，仍然保持旺盛的增殖能力。
　　2、hUSCs的生物學(xué)特性
　　2.1 MTT法檢測細胞增殖能力的結(jié)果顯示hUSCs生長曲線呈S形。
　　2.2流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示分離得到的hUSCs CD4

7、4、CD29、CD90和CD73表達陽性，CD34、CD133和CD45表達陰性，表明其與間充質(zhì)干細胞表達類似的細胞表面標(biāo)志物。
　　2.3體外采用成脂和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別對hUSCs誘導(dǎo)14d和21d后，油紅O和茜素紅染色均為陽性，表明hUSCs體外具有成脂和成骨的分化潛能。
　　3、體外誘導(dǎo)hUSCs向神經(jīng)細胞定向分化
　　q-PCR結(jié)果顯示hUSCs經(jīng)神經(jīng)定向誘導(dǎo)培養(yǎng)7d后Nestin、Sox2、MAP2、NSE

8、、GFAP表達分別上調(diào)8.08±0.95倍、3.75±0.88倍、5.12±0.46倍、2.08±0.11倍和5.60±1.86倍，誘導(dǎo)12d后分別上調(diào)4.47±0.62倍、5.69±0.92倍、2.52±0.61倍、1.63±0.13倍和5.97±0.89倍(P＜0.05);細胞免疫熒光染色檢測結(jié)果顯示經(jīng)神經(jīng)誘導(dǎo)7d后Nestin、Sox2陽性細胞率分別為17.2±0.58％和15.3±1.32％，誘導(dǎo)12d時陽性細胞率分別為62.5

9、±4.48％和33.7±2.76％(P＜0.05)，結(jié)果表明hUSCs體外具有分化為神經(jīng)細胞的潛能。
　　4、GFP-hUSCs腦內(nèi)增殖分化狀況
　　GFP-hUSCs于移植1W和3W后，發(fā)現(xiàn)宿主腦內(nèi)存在GFP陽性細胞，同時部分GFP陽性細胞從腦損傷區(qū)遷移至海馬區(qū)，并且表達GFAP和β-tubulinⅢ，說明移植細胞能夠于宿主腦內(nèi)成功存活、遷移并分化為神經(jīng)細胞。
　　結(jié)論:1、本研究成功建立了從人新鮮尿液中分離培養(yǎng)并大