暴發(fā)性肝衰竭大鼠腎小球毛細(xì)血管容積的變化.pdf

1、目的：
　　 暴發(fā)性肝衰竭(FHF)并發(fā)癥多,病死率高,預(yù)后差,是嚴(yán)重危害人類健康的疾病.肝腎綜合征(hepatorenalsyndrome,HRS)是肝硬化或其他嚴(yán)重肝病時(shí)發(fā)生的一種預(yù)后極差的嚴(yán)重并發(fā)癥,以腎功能衰竭、血流動(dòng)力學(xué)改變和內(nèi)源性血管活性物質(zhì)激活、腎動(dòng)脈顯著收縮導(dǎo)致腎小球?yàn)V過率降低為特征。那么暴發(fā)性肝衰竭大鼠腎小球毛細(xì)血管容積是否發(fā)生相應(yīng)改變呢?我們應(yīng)用D-氨基半乳糖(D-GaIN)聯(lián)合脂多糖(LPS)構(gòu)建暴發(fā)性肝衰

2、竭(FHF)大鼠模型,為了排除血漿中其它血管活性物質(zhì)對(duì)血管舒縮活性的干擾,本實(shí)驗(yàn)用FITC(熒光素——異硫氰酸酯)標(biāo)記的菊粉,通過檢測(cè)腎小球菊粉含量(GIS)前后變化的百分比,計(jì)算腎小球毛細(xì)血管容積的變化。
　　 材料與方法：
　　 1、材料：
　　 選取SPF級(jí)別雄性SD大鼠,體重220±20g,實(shí)驗(yàn)前分籠飼養(yǎng),室溫23±3℃,每隔12h開燈照明,普通飼料,自由飲水,飼養(yǎng)一周后用于實(shí)驗(yàn)。
　　 2、方法

3、：
　　 (1)構(gòu)建暴發(fā)性肝衰竭(FHF)模型,根據(jù)既往研究結(jié)果,選擇D-GalN400mg/kg、LPS32μg/kg的生理鹽水溶液(2ml/kg)尾靜脈注射為建模劑量,根據(jù)肝腎功能損害及肝細(xì)胞壞死情況,確定阻斷時(shí)間點(diǎn)為建模后12h。
　　 (2)分組,分為4組,即:生理鹽水對(duì)照組(NS組);D-GalH/LPS聯(lián)合給藥組(G/L12h組):D-GalH單獨(dú)給藥組(G12h組);LPS單獨(dú)給藥組(L12h組),其中G/

4、L組設(shè)置7只大鼠,其余各組均設(shè)置5只。
　　 (3)測(cè)定各組血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT),尿素氮(BUN),肌酐(Cr),鉀離子(K+),鈉離子(Na+),氯離子(Cl-),腫瘤壞死因子α(TNFα)、內(nèi)皮素-1(ET-1);肝組織常規(guī)HE染色,光鏡下觀察肝細(xì)胞壞死情況及組織結(jié)構(gòu)是否發(fā)生改變。
　　 (4)肝腎組織病理學(xué)檢查,肝組織石蠟包埋固定后切片(4.0μm)常規(guī)HE染色,光鏡下觀察肝細(xì)胞壞死情況。電鏡標(biāo)本常規(guī)脫水

5、包埋,半薄切片經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后光鏡下固定,醋酸鈾及檸檬酸鉛雙重染色后,在JEOUEM-1230型透射電鏡下觀察腎組織超微結(jié)構(gòu)并拍照。
　　 (5)篩網(wǎng)法迅速分離各組大鼠的腎小球,收集到1.5ml的EP管中,最后定容至1.0ml,用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)腎小球數(shù)目(計(jì)數(shù)方法:4000個(gè)腎小球應(yīng)取濃縮液體量=1600/N×稀釋倍數(shù),其中N=計(jì)數(shù)板橫槽上下腎小球數(shù)目之和/2),以400μlPBS(含1%BSA)重懸腎小球4000個(gè),加入FIT

6、C標(biāo)記的菊粉,避光,37℃水浴100g/min搖動(dòng)30min,等分成二管,其中一管加內(nèi)皮素,另一管不加內(nèi)皮素,500g離心1Os,取20μl上清后,棄上清,吸凈殘余液體,向管底沉淀之腎小球團(tuán)塊中加500μl0.3%TritonX-100,重懸后溶解過夜,后應(yīng)用熒光分光光度計(jì)分別檢測(cè)每個(gè)樣品上清及腎小球團(tuán)塊FITC標(biāo)記菊粉的熒光值(FI),激發(fā)波長(zhǎng)為488nm,發(fā)射波長(zhǎng)為515nm,應(yīng)用公式GIS(μl)=FI(腎小球)/FI(上清/20

7、g1)×2000計(jì)算出GIS值,并計(jì)算每個(gè)腎小球收縮前后GIS變化的百分率。
　　 (6)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用spss17.0軟件分析,數(shù)據(jù)均值±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示,采用單因素方差分析,并進(jìn)行均數(shù)兩兩比較,P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、血清肝腎功能生物化學(xué)指標(biāo)
　　 G/L組ALT、BUN、Cr、TNF玖、ET-1均在給藥后12h明顯升高達(dá)峰值,與對(duì)照組相比均有顯著性差異(P＜0.

8、05),并且在12h時(shí)間點(diǎn)G/L組上述五項(xiàng)指標(biāo)分別與G組、L組相比較,均有顯著性差異(P＜0.05),從客觀上排除了D-GalN、LPS藥物本身對(duì)上述五項(xiàng)指標(biāo)的影響。
　　 2、肝腎組織病理學(xué)檢查結(jié)果
　　 肉眼觀察D-GalH/LPS聯(lián)合給藥12h后肝臟呈醬紫色,充血腫脹,彌漫出血點(diǎn),切面有暗紅色淤血或黃色乳糜狀壞死物質(zhì)溢出。光鏡下肝細(xì)胞大片壞死,沒有肝細(xì)胞再生,纖維間隔塌陷,充填大量紅細(xì)胞。電鏡下觀察。腎小球、近曲小

9、管、遠(yuǎn)曲小管結(jié)構(gòu)均正常,提示造模成功。
　　 3、NS組、G12h組、L12h組、G/L12h組腎小球菊粉含量(GIS)
　　 結(jié)果：
　　 G/L12h組GIS與NS組比較明顯降低,有顯著性差異(P=0.000),G/L12h組GIS與G12h組、L12h組相比,均有顯著性差異(P值均為0.000),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1、D-GalH/LPS聯(lián)合打擊SD大鼠,成功構(gòu)建FH