Id1和NF-κB亞單位p65在口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制中的協(xié)同作用研究.pdf

1、目的：
　　口腔鱗狀細(xì)胞癌（Oral Squamous Cell Carcinoma，OSCC）是頭頸部最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率高，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。目前有關(guān)OSCC的發(fā)病機(jī)制尚不清楚；有研究表明分化抑制因子-1（Id1）和核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(NF-κB)在口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）中均高表達(dá)，本研究為探討Id1和NF-κB亞單位P65在OSCC發(fā)病機(jī)制中是否起著協(xié)同作用。
　　方法：
　　1.收集新鮮的OS

2、CC臨床標(biāo)本和對(duì)應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本。
　　2.常規(guī)方法分離和提取鱗癌細(xì)胞，原代細(xì)胞培養(yǎng)、傳代。
　　3.RT-PCR與Western blot檢測(cè)OSCC細(xì)胞中CD133與BMI-1的mRNA及其蛋白的表達(dá)情況。
　　4.用 FACS流式細(xì)胞儀和MACS細(xì)胞儀來(lái)分選出 CD133+BMI-1+細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)。
　　5.構(gòu)建Id1和P65基因的載體。
　　6.用高效電轉(zhuǎn)染辦法分別將Id1和P65載體(單獨(dú)或同時(shí)

3、)轉(zhuǎn)染CA9-22與HOK16B細(xì)胞株細(xì)胞，并檢測(cè)其轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中CD133、BMI-1的表達(dá)變化。
　　7.分別將CD133+BMI-1+細(xì)胞的CA9-22、HOK16B及OSCC細(xì)胞按不同的細(xì)胞數(shù)分別接種到SCID小鼠，觀察異種移植瘤的生長(zhǎng)情況。
　　結(jié)果：
　　1.在OSCC原代培養(yǎng)的細(xì)胞中表達(dá)CD133和BMI-1 mRNA及其蛋白，并可見(jiàn)到OSCC單個(gè)細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CD133和BMI-1；
　　2.成功分選

4、出CD133和BMI-1雙陽(yáng)性的原代OSCC細(xì)胞；
　　3.成功構(gòu)建了Id1和P65基因載體；
　　4.在培養(yǎng)的CA9-22細(xì)胞中，單獨(dú)轉(zhuǎn)染Id1或p65后，無(wú)法檢測(cè)到BMI-1蛋白的表達(dá)；如同時(shí)轉(zhuǎn)染Id1和p65后，可檢測(cè)到細(xì)胞中CD133、 Bmi-1、Cdc2與CD1.的表達(dá)明顯上調(diào)，而這種協(xié)同性上調(diào)表達(dá)可被 CD1抑制劑 arginine vasopressin、Cdc2抑制劑 catharidic aci以及蛋白抑

5、制劑 Cycloheximide所阻斷；在空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中無(wú)法檢測(cè)到Bmi-1,、Cdc2與CD1的表達(dá)；但當(dāng)轉(zhuǎn)染Id1,p65,或Id1+p65后,細(xì)胞均明顯表達(dá)CD133
　　5.CA9-22細(xì)胞轉(zhuǎn)染Id1和p65后，明顯影響細(xì)胞周期的進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖；
　　6.在分別接種10,000個(gè)和100,000個(gè)CD133和BMI-1雙陽(yáng)性細(xì)胞（來(lái)自CA9-22、HOK16B及OSCC提取的細(xì)胞）的SCID裸鼠組中，CD13

6、3和BMI-1雙陽(yáng)性癌細(xì)胞能引發(fā)異種移植瘤的生長(zhǎng)。
　　結(jié)論：
　　1.OSCC新鮮標(biāo)本中含有CD133和BMI-1雙陽(yáng)性細(xì)胞亞群。
　　2.Id1和NF-κB亞單位p65可能通過(guò)Cyclin D1和Cdc2信號(hào)通路，上調(diào)CA9-22細(xì)胞中的CD133與BMI-1表達(dá)，促進(jìn)了細(xì)胞的增殖。
　　3.CD133和BMI-1雙陽(yáng)性細(xì)胞可以啟動(dòng)異種移植瘤的生長(zhǎng)。
　　4.Id1和NF-κB亞單位p65在OSCC發(fā)病