ILK與腦膠質(zhì)瘤對(duì)TMZ耐藥性和EMT的關(guān)系及機(jī)制的研究.pdf

1、前言
　　腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的起源于神經(jīng)上皮組織的原發(fā)惡性腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的46％。統(tǒng)計(jì)資料表明腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病率為3～10/10萬(wàn)，占全身惡性腫瘤的1％～3％，手術(shù)加放化療的平均生存期僅為8～11個(gè)月。膠質(zhì)瘤對(duì)化療藥物耐藥導(dǎo)致了化療對(duì)膠質(zhì)瘤治療效果不理想，是膠質(zhì)瘤術(shù)后平均生存期較低的主要原因之一。因此，研究膠質(zhì)瘤對(duì)化療藥物的耐藥機(jī)制，對(duì)于開(kāi)發(fā)新的化療藥物，尋找膠質(zhì)瘤新的治療靶點(diǎn)都具有十分重要的意義。
　　整合素連

2、接激酶(integrinlinkedkinase，ILK)是Hannigan等人在1996年人類(lèi)cDNA文庫(kù)雙酵母雜交篩選實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用β1整合素胞漿結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)的，它是一種含有3個(gè)結(jié)構(gòu)域的Ser/Thr蛋白激酶，ILK的cDNA全長(zhǎng)為1.8kb，由452個(gè)氨基酸殘基組成。編碼人類(lèi)ILK的基因定位于人染色體11p15.5-p15.4，基因全長(zhǎng)為8.8kb，包括13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子。ILK活性較低，在細(xì)胞與ECM粘附時(shí)或生長(zhǎng)因子作用下，

3、通過(guò)PI3K依賴(lài)激活機(jī)制被激活，可能的調(diào)控機(jī)制為PI3K的產(chǎn)物3，4，5-三磷酸肌醇PIP3通過(guò)磷酸肌醇結(jié)合序列和ILK的PH序列直接結(jié)合而發(fā)揮作用。ILK可以被PTEN和ILKAP兩個(gè)磷酸酶負(fù)性調(diào)控。在ILK過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中分析ILK活性，發(fā)現(xiàn)它能激活多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑。上皮細(xì)胞ILK過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致PKB/Akt和GSK-3磷酸化表達(dá)增加。近年來(lái)幼大量的研究表明ILK可通過(guò)誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性表型出現(xiàn)，多種類(lèi)型腫瘤E

4、MT中通過(guò)NF-κB通路起著重要的調(diào)控作用。Duxbury等人的研究還表明通過(guò)RNAi抑制ILK的表達(dá)可降低胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的化療耐藥性，提示ILK可能與腫瘤的多藥耐藥有關(guān)。然而，ILK是否也與腦膠質(zhì)瘤的耐藥有關(guān)仍然不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)過(guò)表達(dá)ILK研究其對(duì)膠質(zhì)瘤耐藥性的影響;通過(guò)轉(zhuǎn)染ILK基因觀察其是否可以引起重組轉(zhuǎn)染組腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力增加及其機(jī)制;應(yīng)用NF-κB阻斷劑阻斷該通路，探討ILK是否通過(guò)NF-κB通路調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞

5、的EMT。
　　材料和方法
　　一、過(guò)表達(dá)ILK促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺耐藥
　　擴(kuò)增人ILK全長(zhǎng)編碼序列，將目的基因和真核表達(dá)載體pEWP-C1質(zhì)粒（含Neo抗性基因）行定向連接，將其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞，應(yīng)用PCR方法鑒定陽(yáng)性克隆，并行測(cè)序和分析對(duì)比，可獲得融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒載體pEGFP-C1-ILK。然后通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)將重組質(zhì)粒pEGFP-C1-ILK轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的SHG-44細(xì)胞，經(jīng)G418篩選，建

6、立穩(wěn)定表達(dá)ILK的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系。
　　實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分三組:對(duì)照組、空載組及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組。
　　應(yīng)用Westernblot和RTPCR法進(jìn)行轉(zhuǎn)染鑒定。應(yīng)用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖，應(yīng)用Hoechst法及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡，并檢測(cè)抗凋亡蛋白、凋亡蛋白的表達(dá)情況及Caspase的活性。
　　二、過(guò)表達(dá)ILK促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移
　　實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分三組:對(duì)照組、空載組及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組
　　分別應(yīng)用Elisa法及

7、Westernblot法檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）9、2的表達(dá)
　　應(yīng)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞遷移率，應(yīng)用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲的程度。利用相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。
　　三、過(guò)表達(dá)ILK通過(guò)NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化
　　分別應(yīng)用NF-κB特異性阻斷劑BAY11-7028及siRNA方法阻斷NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路
　　實(shí)驗(yàn)分七組:對(duì)照組、空載組、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組、空載+BAY11-70

8、28組、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染+BAY11-7028組、空載+p65siRNA組、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染+p65siRNA組
　　首先應(yīng)用Westernblot方法檢測(cè)對(duì)照組、空載組及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組的EMT標(biāo)記物snail、slug、twist、vimentin、E-cadherin蛋白表達(dá)的檢測(cè)，然后阻斷NF-κB信號(hào)通路后，再次檢測(cè)上皮標(biāo)記物E-cadherin蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果
　　一、過(guò)表達(dá)ILK促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺耐藥
　　重

9、組質(zhì)粒pEGFP-C1-ILK鑒定:所得的PCR片段和預(yù)期大小1.8kbp相一致。將陽(yáng)性克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果應(yīng)用cnkiblast分析，證實(shí)插入的目的片段與基因庫(kù)檢索的人ILK的cDNA序列100％匹配，證明PCR過(guò)程中無(wú)突變發(fā)生。以上結(jié)果證實(shí)重組質(zhì)粒pEGFP-C1-ILK構(gòu)建成功。然后應(yīng)用G418篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ILK的SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞系。
　　轉(zhuǎn)染鑒定:Westernblot的結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染組的ILK蛋白表達(dá)明顯高于空載組

10、及對(duì)照組(P＜0.01)，RT-PCR顯示:穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組ILK明顯高于對(duì)照組的表達(dá)(P＜0.01)，以上的結(jié)果證實(shí)ILK轉(zhuǎn)染成功。
　　Westernblot法檢測(cè)各組細(xì)胞中多藥耐藥基因MDR、MRP蛋白質(zhì)的表達(dá)結(jié)果顯示:穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的MDR、MRP蛋白質(zhì)表達(dá)均明顯增高，說(shuō)明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ILK的膠質(zhì)瘤細(xì)胞并未失去合成多藥耐藥基因蛋白的功能，因此從功能上來(lái)說(shuō)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的ILK的SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞保持了原腫瘤細(xì)胞的功能特性。
　　

11、MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖結(jié)果顯示:在24小時(shí)，48小時(shí)及72小時(shí)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)（ILK+TMZ組）的OD值明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.01;以上結(jié)果說(shuō)明過(guò)表達(dá)ILK能夠促進(jìn)SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。
　　Hoechst法檢測(cè)結(jié)果:免疫熒光顯微鏡下，凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞核致密濃染或碎塊狀致密濃染，（穩(wěn)定轉(zhuǎn)染+TMZ）組凋亡細(xì)胞明顯少于（空載體+TMZ）組，說(shuō)明過(guò)表達(dá)ILK能減少膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，即降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TMZ的敏感性

12、。
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè):（穩(wěn)定轉(zhuǎn)染+TMZ）組早期凋亡細(xì)胞明顯少于（空載體+TMZ）組，說(shuō)明過(guò)表達(dá)ILK可以減少膠質(zhì)瘤細(xì)胞在TMZ作用下的凋亡，即降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TMZ的敏感性。
　　Westernblot檢測(cè)結(jié)果:(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染+TMZ)組與(空載+TMZ)組比較，可以明顯提高腫瘤細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)可以明顯減少凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)。結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)ILK可以增加抗凋亡蛋白表達(dá)，同時(shí)減少凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，從

13、而減少膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，降低了腫瘤細(xì)胞對(duì)TMZ的敏感性。
　　試劑盒法檢測(cè)Caspase3活性檢測(cè):caspase-3的活性在(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染+TMZ)組明顯低于(空載體+TMZ)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，該結(jié)果說(shuō)明過(guò)表達(dá)ILK可以降低凋亡關(guān)鍵酶caspase-3的活性，從而減少膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，降低了腫瘤細(xì)胞對(duì)TMZ的敏感性。
　　二、過(guò)表達(dá)ILK促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移
　　Elisa法檢測(cè)結(jié)果和Weste

14、rnblot法檢測(cè)結(jié)果一致:穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組的MMP-9、MMP-2表達(dá)均明顯增加，與對(duì)照組及空載組比較（P＜0.01）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn):6小時(shí):空白對(duì)照組、空載組、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ILK組，細(xì)胞遷移率分別為:30％，33％，68％;12小時(shí):空白對(duì)照組、空載組、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ILK組，細(xì)胞遷移率分別為:77％，76％，95％。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ILK腫瘤細(xì)胞移動(dòng)速率增加(P＜0.01)，而對(duì)照組及空載組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.01)

15、。實(shí)驗(yàn)表明過(guò)表達(dá)ILK可明顯增加SHG44腫瘤細(xì)胞的遷徙能力。
　　Transwell小室法:種植的各組細(xì)胞在培養(yǎng)24小時(shí)以后，計(jì)數(shù)膜的下表面細(xì)胞數(shù)結(jié)果:對(duì)照組和空載體組和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ILK組的細(xì)胞遷移數(shù)分別為:92、87、229。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ILK的細(xì)胞穿透膜的數(shù)目明顯高于其他兩組(P＜0.01)，而對(duì)照組與空載組的細(xì)胞穿透膜的數(shù)目無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.01)，表明過(guò)表達(dá)ILK可明顯增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(SHG44)的侵襲能力。
　　三

16、、過(guò)表達(dá)ILK通過(guò)NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化
　　Westernblot檢測(cè)EMT標(biāo)記物蛋白的表達(dá):結(jié)果顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組中snail，slug，twist，vimentin的表達(dá)較對(duì)照組及空載組的表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而E-cadherin的表達(dá)則在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組中明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　當(dāng)分別用NF-kB特異性阻斷劑BAY11-7028及p65SiRNA的

17、方法阻斷該通路后，Westernblot方法檢測(cè)E-cadherin蛋白表達(dá)結(jié)果顯示:穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組中E-cadherin蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　結(jié)論
　　1.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ILK的SHG-44腫瘤細(xì)胞系建立及篩選成功，并且該穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系ILK明顯過(guò)表達(dá)。
　　2.過(guò)表達(dá)ILK可以通過(guò)增加抗凋亡蛋白的表達(dá)，降低凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)、下調(diào)caspase-3的活性、抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡、促進(jìn)其增殖，降