羥基芫花素配伍芹菜素體外協(xié)同抗膠質(zhì)瘤作用及其機制研究.pdf

1、目的:初步探索羥基芫花素與芹菜配伍協(xié)同抗膠質(zhì)瘤作用及其分子機制
　　方法:MTT法檢測經(jīng)不同濃度的芹菜素、羥基芫花素、羥基芫花素+芹菜素（配伍組）處理不同時間后的C6膠質(zhì)瘤細胞增殖情況，初步判定各組藥物抑制C6膠質(zhì)瘤增殖的時間依賴、濃度依賴特點。用AO/EB(acridineorange/ethidiumbromide，吖啶橙/溴化乙錠)和DAPI（4，6-diamidino-2-phenylindole，4，6-二脒基-2-苯基

2、吲哚）熒光染色的方法檢測核固縮等細胞凋亡形態(tài)變化;應(yīng)用掃描電鏡(transmissionelectronmicroscope，TEM)和JC-1熒光探針的方法從形態(tài)和功能的角度檢測各組藥物對線粒體結(jié)構(gòu)和膜電位的損傷情況;單細胞凝膠電泳(singlecellgeleletrophoresis，SCGE)實驗檢測細胞DNA損傷;流式細胞儀檢測各組藥物對C6細胞的周期阻滯作用。在分子機制研究方面，采用Westernblot考察了各組藥物對線粒

3、體凋亡通路相關(guān)抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-xl）和凋亡誘導(dǎo)蛋白(Bax、Bak、Bid、Bad)表達的影響;利用放免試劑盒測定了經(jīng)各組藥物處理后C6膠質(zhì)瘤細胞上清液中TNF-α的濃度;Caspase活性測定試劑盒檢測各組藥物對腫瘤細胞Caspase-3和8酶活性的影響。
　　結(jié)果:羥基芫花素和芹菜素在總藥物濃度為25μM時對C6膠質(zhì)瘤細胞均有一定的抗增殖效應(yīng)，其中羥基芫花素的抗膠質(zhì)瘤效應(yīng)稍強于芹菜素;當(dāng)二者配伍聯(lián)合應(yīng)用后，聯(lián)合

4、用藥組的抗膠質(zhì)瘤效應(yīng)明顯強于各單用藥組;AO/EB染色、DAPI染色結(jié)果表明羥基芫花素和芹菜素是通過誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的方式達到抗增殖效應(yīng);進一步機制研究表明，羥基芫花素對線粒體結(jié)構(gòu)和功能（線粒體膜電位）造成明顯的損傷，聯(lián)合用藥組表現(xiàn)出明顯的協(xié)同效應(yīng);SCGE檢測到各處理組中腫瘤細胞DNA損傷。細胞周期分析表明，羥基芫花素具有明顯的S期阻滯效應(yīng)，而芹菜素對腫瘤細胞周期無明顯的阻滯效應(yīng);進一步分子機制研究表明，相對于對照組，羥基芫花素和芹菜

5、素能明顯增強腫瘤細胞TNF-α的表達、增強Caspase活化，當(dāng)聯(lián)合應(yīng)用后二者表現(xiàn)出明顯的協(xié)同效應(yīng)。但是Westernblot結(jié)果分析表明，羥基芫花素和芹菜素對線粒體凋亡通路某些關(guān)鍵蛋白表達的影響具有無明顯的協(xié)同效應(yīng);藥物毒性初步評估結(jié)果表明，在一定濃度下，羥基芫花素對高分化的PC12細胞系無明顯毒性效應(yīng)（IC50＞120μM）。
　　結(jié)論:羥基芫花素具有一定的抗膠質(zhì)瘤作用，當(dāng)羥基芫花素與芹菜素聯(lián)合應(yīng)用后，二者表現(xiàn)出明顯的協(xié)同增效