丹參多種有效單體均勻設(shè)計(jì)——高通量篩選及其藥效學(xué)研究.pdf

1、近些年來，社會(huì)人口老齡化問題日益加重，腦血管疾病的發(fā)病率也在逐年上升，缺血性腦血管疾病已經(jīng)成為重點(diǎn)防治的老年性疾病之一。研究表明，我國傳統(tǒng)中藥丹參在缺血性腦病治療方面有一定療效，在缺血性腦血管疾病發(fā)病的多個(gè)環(huán)節(jié)顯示出一定的治療作用。
　　本研究采用均勻設(shè)計(jì)-高通量篩選技術(shù)這一嶄新的研究模式，對(duì)丹參多種單體的配伍組合進(jìn)行高通量篩選及藥效學(xué)研究。實(shí)驗(yàn)選丹參酮Ⅰ(Y1)、丹參酮ⅡA(Y2)、隱丹參酮(Y3)、二氫丹參酮Ⅰ(Y4)、原兒茶

2、醛(Y5)、原兒茶酸(Y6)、迷迭香酸(Y7)、咖啡酸(Y8)、丹參素鈉(Y9)、丹酚酸A(Y10)、丹酚酸B(Y11)、三七皂苷R1(Y12)、人參皂苷Rb1(Y13)、人參皂苷Rg1(Y14)等丹參有效單體及冰片(Y15)共15種單體成分。分組情況如下:A、a組分別含相同的7種單體成分(Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11)，其中A組各單體成分分別在1×10-3～1×10-9 mol·L-1七個(gè)濃度水平進(jìn)行配伍組合，a組在1

3、×10-3、0.5×10-3、1×10-4、0.5×10-4、1×10-5、0.5×10-5、1×10-6mol·L-1七個(gè)濃度水平進(jìn)行配伍組合;B、b亦分別組含有相同的7種單體成分(Y2、Y3、Y11、Y12、Y13、Y14、Y15)，其中B組各單體成分分別在1×10-3～1×10-9 mol·L-1七個(gè)濃度水平進(jìn)行配伍組合，b組在1×10-3、0.5×10-3、1×10-4、0.5×10-4、1×10-5、0.5×10-5、1×10

4、-6 mol·L-1七個(gè)濃度水平進(jìn)行配伍組合;C、c組分別含有相同的11種單體成分(Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11)，其中C組各單體分別在1×10-3～1×10-8 mol·L-1六個(gè)濃度水平進(jìn)行配伍組合，c組則在1×10-3、0.5×10-3、1×10-4、0.5×10-4、1×10-5、0.5×10-5 mol·L-1六個(gè)濃度水平上進(jìn)行配伍組合。
　　各組樣品按照相應(yīng)均勻設(shè)計(jì)表進(jìn)行配伍，得

5、到多種組合樣品。以上6組共可得到104種組合樣品，分別以A1～A14、a1～a14、B1～B14、b1～b14、C1～C24、c1～c24表示，通過清除DPPH自由基及還原能力實(shí)驗(yàn)等體外抗氧化檢測(cè)方法，對(duì)所得組合樣品進(jìn)行高通量藥效篩選，比較各組多種單體成分、多種濃度梯度配伍組合的抗DPPH能力和還原能力的大小，并對(duì)所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行《均勻設(shè)計(jì)與參數(shù)優(yōu)化WUST軟件包》的多元逐步回歸分析，得到優(yōu)化結(jié)果，根據(jù)優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行配伍，得到優(yōu)化組合

6、，將各組配伍組合樣品同優(yōu)化組合樣品一起，重復(fù)以上清除DPPH自由基及還原能力實(shí)驗(yàn)，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選出高活性組合樣品，完成對(duì)配伍組合樣品的初步藥效探索（初篩）。以神經(jīng)細(xì)胞為作用靶點(diǎn)，通過H2O2建立海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷模型，維生素E為陽性對(duì)照，考察初篩組合樣品及優(yōu)化組合樣品對(duì)模型細(xì)胞生存率影響力的大小，對(duì)初篩結(jié)果做進(jìn)一步細(xì)胞藥效學(xué)高通量篩選研究（復(fù)篩），并最終得到最佳配伍組合樣品。
　　1體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各配伍

7、組合樣品抗DPPH作用（DPPH自由基清除率）最高為48.92％，還原能力最高為62.26％，而脂溶性成分相對(duì)較多的B、b組抗DPPH作用及還原能力普遍較低，其中抗DPPH作用最高為38.80％，還原能力最高為33.74％。
　　2細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，組合樣品對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用顯著（細(xì)胞生存率＞72％，最高為94.9％），明顯高于陽性對(duì)照藥VE(細(xì)胞生存率為75.4％)。最終獲得3個(gè)最佳組合樣品a11、P1、

8、P4（細(xì)胞生存率＞90％）。
　　經(jīng)過初篩和復(fù)篩，最終得到的a11、P1和P4三種最佳配伍組合，它們對(duì)損傷海馬細(xì)胞的保護(hù)作用顯著，細(xì)胞生存率大于90％，明顯高于陽性對(duì)照藥維生素E及其所含各單體在相同濃度下的細(xì)胞保護(hù)作用。結(jié)果顯示最佳配伍組合樣品抗氧化作用及細(xì)胞保護(hù)作用與它們所含有效單體的總物質(zhì)的量濃度并無明顯相關(guān)性，這一結(jié)果可能與其多因素、多靶點(diǎn)、多作用途徑有關(guān)。研究亦表明均勻設(shè)計(jì)-高通量篩選技術(shù)適合中藥的多因素多水平藥效研究，可