肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞抗凋亡效應(yīng)及分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：克隆肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)基因，構(gòu)建重組真核表達(dá)載體;觀察HGF蛋白誘導(dǎo)經(jīng)足葉乙甙(VP-16)處理后人慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞(K562細(xì)胞)拮抗凋亡效應(yīng);HGF基因重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，觀察HGF基因的表達(dá)及基因轉(zhuǎn)染對(duì)K562細(xì)胞凋亡發(fā)生的抑制作用，闡述HGF誘導(dǎo)K562細(xì)胞抗凋亡效應(yīng)的分子機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.HGF基因的克隆與重組克隆載體的構(gòu)建及鑒定提取人肝組織總RNA，采用RT-P

2、CR，獲得HGF基因cDNA，與載體pMD19-TSimple連接，構(gòu)建pMD19-T simple-HGF重組克隆載體。轉(zhuǎn)化重組克隆載體pMD19-TSimple-HGF的大腸桿菌E.Coli DH5α，經(jīng)氨芐青霉素篩選獲得陽(yáng)性菌株，增菌后采用菌落直接PCR、測(cè)序等方法鑒定HGF基因重組克隆載體。
　　 2.HGF基因重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定HGF基因重組克隆載體pMD19-T Simple-HGF行MluⅠ、SalⅠ雙酶

3、切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，與載體pVITRO2-mcs連接構(gòu)建重組表達(dá)載體pVITRO2-mcs-HGF。以冷CaCl2法轉(zhuǎn)化E.Coli DH5α，經(jīng)潮霉素B進(jìn)行篩選，采用PCR、酶切等方法進(jìn)行鑒定。
　　 3.潮霉素B篩選濃度的確定取轉(zhuǎn)染后處對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562細(xì)胞，分別加入不同濃度的潮霉素B，于37℃，5％CO2靜置培養(yǎng)，以培養(yǎng)10～14天后無(wú)K562細(xì)胞存活的最小濃度為潮霉素B篩選濃度。
　　 4.HGF基

4、因的轉(zhuǎn)染與陽(yáng)性克隆鑒定脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組表達(dá)載體pVITRO2-mcs-HGF轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，37℃、5％CO2靜置培養(yǎng)24 h后，加入潮霉素B進(jìn)行篩選。以未處理K562細(xì)胞、加脂質(zhì)體K562細(xì)胞為空白對(duì)照，以轉(zhuǎn)染載體pVITRO2-mcs質(zhì)粒K562細(xì)胞為陰性對(duì)照。篩選后取存活細(xì)胞稀釋后行單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)形成克隆并擴(kuò)大。取擴(kuò)大后K562細(xì)胞，提取總RNA，行RT-PCR法檢測(cè)HGF基因的存在。
　　 5.HGF基因轉(zhuǎn)染后重組蛋白

5、表達(dá)的檢測(cè)采用Western blot檢測(cè)HGF基因轉(zhuǎn)染后K562細(xì)胞提取物中重組蛋白。以未轉(zhuǎn)染組、載體pVI TRO2-mcs轉(zhuǎn)染組作為對(duì)照。
　　 采用ELISA法定量測(cè)定第1、9、16代培養(yǎng)物上清中重組蛋白濃度。
　　 6.HGF基因轉(zhuǎn)染后mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)分別提取第1、9、16代的重組載體pVITRO2-mcs-HGF轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞總RNA，RT后采用實(shí)時(shí)FQ-PCR檢測(cè)HGF基因mRNA的表達(dá)水平，評(píng)價(jià)

6、其表達(dá)的穩(wěn)定性，以未轉(zhuǎn)染組、載體pVITRO2-mcs轉(zhuǎn)染組為對(duì)照組。
　　 7.CCK-8細(xì)胞毒性試驗(yàn)確定VP-16的凋亡誘導(dǎo)濃度經(jīng)37℃，5％ CO2培養(yǎng)12h，加入不同濃度的VP-16(0.1～400μg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后加入CCK-8工作液，孵育3～5 h，經(jīng)酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，以達(dá)到50％抑制率的最小濃度為VP-16工作濃度。
　　 8.透射電鏡檢測(cè)凋亡細(xì)胞形態(tài)K562細(xì)胞置37℃、5％ CO2靜置培養(yǎng)

7、12h后，加入VP-16處理24 h，離心收集，用戊二醛和鋨酸行雙固定，依序經(jīng)乙醇、純丙酮脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，超薄切片，電鏡下觀察。以未經(jīng)VP-16誘導(dǎo)細(xì)胞為對(duì)照組。
　　 9.HGF抗K562細(xì)胞凋亡的體外實(shí)驗(yàn)K562細(xì)胞接種后加入HGF蛋白（終濃度為100 ng/ml），或HGF基因轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞，常規(guī)靜置培養(yǎng)24 h，VP-16（終濃度1μg/ml）處理24 h后，再按相關(guān)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（設(shè)對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組等）進(jìn)行操作。

8、>　　 10.蘇木素-伊紅(HE)染色檢測(cè)HGF對(duì)細(xì)胞凋亡的影響取細(xì)胞制涂片，乙醇固定，分別經(jīng)核染液色液、分色液Ⅰ、分色液Ⅱ、漿染液染色處理，用增色液洗去多余的染液，吸干封片鏡檢，鏡下計(jì)數(shù)。
　　 11.吖啶橙(AO)染色檢測(cè)HGF對(duì)K562細(xì)胞凋亡的影響收集細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，加吖啶橙染淮室溫避光染色15 min，加甘油，蓋玻片封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。
　　 12.流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)磷脂酰絲氨酸(P

9、S)外翻與核膜完整性觀察HGF對(duì)細(xì)胞早期凋亡的影響收集經(jīng)相關(guān)處理后細(xì)胞，制備單個(gè)細(xì)胞懸液，行Annexin V-FI TC/PI雙染，1h內(nèi)行FCM檢測(cè)。
　　 13.FCM檢測(cè)線粒體膜電位改變觀察HGF對(duì)細(xì)胞早期凋亡的影響收集細(xì)胞，行JC-1染色，孵育，洗滌，重懸，上機(jī)檢測(cè)。
　　 14.凋亡相關(guān)基因mRNA的檢測(cè)同上經(jīng)相關(guān)處理后，TrizoI法提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后行PCR，采用SYBRGreen熒光染料法半

10、定量檢測(cè)Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9等凋亡相關(guān)基因mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.HGF基因的克隆與重組克隆載體的構(gòu)建與鑒定肝組織總RNA提取物行RT-PCR，凝膠電泳可見(jiàn)一特異性條帶，與目的片段一致(2229 bp)，提示成功克隆HGF cDNA。將HGF cDNA與pMD19-T Simple-連接，并轉(zhuǎn)化E.Coli DH5α，篩選出陽(yáng)性菌落。將陽(yáng)性菌落直接PCR產(chǎn)物、重組克

11、隆載體SalⅠ、MluⅠ雙酶切產(chǎn)物及未酶切重組載體進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)特異性條帶存在。同時(shí)，取純化重組克隆載體pMD19-T Simple-HGF行測(cè)序，結(jié)果與Genebank報(bào)道的序列相同，提示HGF基因重組克隆載體pMD19-T Simple-HGF成功構(gòu)建。
　　 2.HGF基因重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定HGF基因重組克隆載體pMD19-T Simple-HGF行雙酶切后取目的片段與pVITRO2-mcs連接，采用潮

12、霉素B篩選pVITRO2-mcs-HGF轉(zhuǎn)化E.Coli DH5α后的陽(yáng)性菌落。將HGF基因的RT-PCR產(chǎn)物、陽(yáng)性菌落直接PCR產(chǎn)物、重組表達(dá)載體Sal和MluⅠ雙酶切產(chǎn)物、重組表達(dá)載體提取物等同時(shí)電泳，發(fā)現(xiàn)存在與目的片段大小一致的特異性條帶(2229 bp)，提示HGF基因重組真核表達(dá)載體pVITRO2-mcs-HGF構(gòu)建成功。
　　 3.篩選用潮霉素B濃度的確定經(jīng)不同濃度潮霉素B處理10～14天后，觀察K562細(xì)胞存活情況

13、，確定75μg/ml作為實(shí)驗(yàn)用潮霉素B篩選濃度。
　　 4.HGF基因轉(zhuǎn)染后陽(yáng)性K562細(xì)胞的篩選及鑒定經(jīng)75μg/ml潮霉素B處理1w，各組均出現(xiàn)大面積細(xì)胞死亡，至14d時(shí)空白組、陰性組均死亡，而實(shí)驗(yàn)組仍存活。存活細(xì)胞經(jīng)潮霉素B作用下行單個(gè)細(xì)胞克隆擴(kuò)大培養(yǎng)。提取擴(kuò)大培養(yǎng)后細(xì)胞總RNA行RT-PCR,電泳擴(kuò)增產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存在特異性的條帶(2229 bp)，提示HGF基因重組表達(dá)載體pVITRO2-mcs-HGF成功轉(zhuǎn)染K5

14、62細(xì)胞。
　　 5.HGF基因轉(zhuǎn)染后重組蛋白表達(dá)的檢測(cè)經(jīng)Western blot發(fā)現(xiàn)HGF基因轉(zhuǎn)染后的K562細(xì)胞裂解液存在大小約85 kDa蛋白條帶，而未轉(zhuǎn)染組和載體pVITRO2-mcs轉(zhuǎn)染組均為陰性，提示HGF基因轉(zhuǎn)染后K562細(xì)胞后可表達(dá)重組蛋白。
　　 ELISA定量檢測(cè)第1、9、16代培養(yǎng)物中重組蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn):第1、9、16代重組蛋白分別4.52±0.35 ng/ml、4.47±0.54 ng/ml、4.

15、37±0.28 ng/ml，代間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，提示HGF基因轉(zhuǎn)染后可在K562細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)。
　　 上述結(jié)果證實(shí)HGF基因轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞后穩(wěn)定表達(dá)。
　　 6.HGF基因轉(zhuǎn)染后HGF mRNA表達(dá)的檢測(cè)采用實(shí)時(shí)FQ-PCR檢測(cè)第1、9、16代培養(yǎng)物HGF mRNA的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn):第1、9、16代HGF基因轉(zhuǎn)染組的HGF mRNA分別為7.89±0.38、6.79±0.52、6.62±0.48，代間

16、差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而對(duì)照組呈無(wú)或極弱表達(dá)，提示HGF基因轉(zhuǎn)染后可在K562細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)。
　　 7.CCK-8法檢測(cè)VP-16對(duì)細(xì)胞增殖的影響CCK-8檢測(cè)不同濃度VP-16對(duì)K562細(xì)胞增殖影響的結(jié)果顯示，抑制效果隨著VP-16濃度增加而明顯增強(qiáng)，24 h內(nèi)達(dá)到半數(shù)抑制率（48.4±5.6）％的最低濃度為1μg/ml，確定將1μg/ml作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的VP-16誘導(dǎo)濃度。
　　 8.透射電鏡觀察經(jīng)VP-1

17、6誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)的變化經(jīng)VP-16處理后在透射電鏡下發(fā)現(xiàn):對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)正常，而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞可見(jiàn)典型凋亡細(xì)胞的形態(tài)改變，提示VP-16可以有效誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　 9.HE染色檢測(cè)HGF對(duì)細(xì)胞凋亡的影響HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VP-16處理的細(xì)胞凋亡率顯著增加，明顯高于未處理組（P＜0.001，P＜0.05），但HGF蛋白組凋亡率明顯低于VP-16處理組(P＜0.05);未轉(zhuǎn)染組、載體pVITRO2-mcs轉(zhuǎn)染組和HGF基因轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞

18、經(jīng)VP-16處理后，凋亡率明顯增加(P＜0.05，P＜0.05，P＜0.05)，提示VP-16可有效誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但HGF基因轉(zhuǎn)染組的凋亡率明顯低于其他組(P＜0.001，P＜0.001)，提示HGF可抑制凋亡發(fā)生。
　　 10.AO染色檢測(cè)HGF對(duì)K562細(xì)胞凋亡的影響AO染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)VP-16處理組的凋亡率顯著高于未處理組(P＜0.001)，而HGF蛋白組的凋亡率明顯低于VP-16處理組（P＜0.05）;經(jīng)VP-16處理

19、后，HGF基因轉(zhuǎn)染組的凋亡率顯著低于未轉(zhuǎn)染組和載體pVITRO2-mcs轉(zhuǎn)染組(P＜0.05，P＜0.05)，提示表明HGF可抑制VP-16所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　 11.FCM檢測(cè)PS外翻與核膜完整性觀察HGF對(duì)K562細(xì)胞早期凋亡的影響FCM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)VP-16處理后，各組早期凋亡的細(xì)胞率顯著增加(P＜0.001，P＜0.001)，但HGF蛋白組的凋亡率明顯較低(P＜0.05);經(jīng)VP-16處理后，載體pVITRO2-mc

20、s轉(zhuǎn)染組、未轉(zhuǎn)染組和HGF基因轉(zhuǎn)染組的凋亡率顯著增高(P＜0.05)，但HGF基因轉(zhuǎn)染組的凋亡率明顯低于其他組（P＜0.05，P＜0.05），證實(shí)HGF具拮抗早期凋亡發(fā)生的作用。
　　 12.FCM檢測(cè)線粒體膜電位改變觀察HGF對(duì)K562細(xì)胞早期凋亡的影響線粒體膜電位變化檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)VP-16處理后，線粒體膜電位的化顯著增加（P＜0.001），但HGF蛋白組明顯較低（P＜0.001）;經(jīng)VP-16處理后，載體pVITRO2-

21、mcs轉(zhuǎn)染組、未轉(zhuǎn)染組和HGF基因轉(zhuǎn)染組的線粒體膜電位的變化率顯著增高(P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001)，而HGF基因轉(zhuǎn)染組的變化明顯低于其他組(P＜0.001，P＜0.001)，提示HGF具抑制早期凋亡發(fā)生的作用。
　　 13.凋亡相關(guān)基因mRNA的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VP-16處理后各組Bcl-2 mRNA表達(dá)量均明顯低于未處理組(P＜0.001)，但HGF蛋白組的Bcl-2mRNA表達(dá)量明顯高于VP-16處理組(

22、P＜0.001);VP-16處理后各組Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、Caspase-9 mRNA表達(dá)量均明顯高于未處理組(P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001)，而HGF蛋白組Bax mRNA、Caspase-3mRNA、Caspase-9 mRNA表達(dá)量明顯低于VP-16處理組(P＜0.05，P＜0.001，P＜0.001)。對(duì)HGF基因轉(zhuǎn)染的的各組細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bcl-2、Bax、Caspase-3和C