大腸桿菌K88ac-STⅡ融合基因在減毒鼠傷寒沙門氏菌中的表達(dá)與免疫.pdf

1、本文構(gòu)建了表達(dá)大腸桿菌菌毛蛋白K88ac和熱穩(wěn)定腸毒素STII融合基因的無抗性減毒鼠傷寒沙門氏菌疫苗株,并對其免疫效果進(jìn)行了研究。 本研究根據(jù)GenBank中登錄號為m29375的K88ac基因序列以及減毒鼠傷寒沙門氏菌原核表達(dá)載體,pYA3334的多克隆位點設(shè)計特異性引物P1、P2,并在上下游引物的5’端分別引入NcoI和BamHI酶切位點,從大腸桿菌DE3(pET-K88ac-STII)中通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增得到

2、K88ac-STII融合基因?；厥占兓髮88ac-STII融合基因用T4DNA連接酶連于克隆載體pBS-T上,熱擊轉(zhuǎn)化受體大腸桿菌Top10,藍(lán)白斑篩選陽性菌落,酶切鑒定證明其中含有K88ac-STII融合基因片段,再測序鑒定該融合基因序列的正確性,命名為pBS-K88ac-STII。之后采用缺失腺苷酸環(huán)化酶基因(△cya)、環(huán)腺苷酸受體蛋白基因(△crp)以及天冬氨酸β-半醛脫氫酶基因(△asd)的鼠傷寒沙門氏菌(X4550)作為

3、宿主,將編碼K88ac-STII的融合基因切下插入Asd+組成型表達(dá)載體pYA3334中,鑒定后通過電轉(zhuǎn)化引入宿主菌X4550中,再次酶切鑒定正確后,過夜培養(yǎng)進(jìn)行SDS-PAGE和Western-Blot試驗,檢測其特異性蛋白表達(dá)情況。最后分別以重組菌株X4550(pYA3334-K88ac-STII)灌服小鼠作為試驗組,以轉(zhuǎn)化了空載體的菌株X4550(pYA3334)作為空載體對照組,同時設(shè)PBS空白對照組,分別對三個分組的小鼠進(jìn)行免

4、疫,采集血清檢測其抗體效價,之后免疫小鼠用強毒株C83915(STII+)攻擊,觀察結(jié)果。 本實驗成功構(gòu)建了表達(dá)K88ac-STII融合基因平衡致死的減毒鼠傷寒沙門氏重組菌株X4550(pYA3334-K88ac-STII),該重組菌株在33Kda處有特異性表達(dá)的蛋白條帶,與預(yù)期分子量大小-致,而空載體對照菌X4550(pYA3334)在該處未有相應(yīng)條帶出現(xiàn)。Western-blot免疫印跡結(jié)果顯示重組菌株X4550(pYA33

5、34-K88ac-STII)表達(dá)的蛋白能夠被K88ac陽性血清特異性結(jié)合,在相應(yīng)位置出現(xiàn)特異性顯色條帶。這證明重組菌株能夠表達(dá)K88ac-STII特異性融合蛋白,重組菌的體外穩(wěn)定實驗也證明其有良好的穩(wěn)定性,從而保證了K88ac-STII抗原能夠得以持續(xù)表達(dá)。而且試驗小鼠灌喂重組減毒鼠傷寒沙門氏菌X4550(pYA3334-K88ac-STII)后,能夠產(chǎn)生特異性的抗體,而且對大腸桿菌強毒株具有一定的抵抗力。這為進(jìn)一步研制相應(yīng)的抗仔豬大腸