Caveolin-1對小鼠肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化、凋亡及N-聚糖分支合成的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、胞膜窖（caveolae）是50～100nm燒瓶狀的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，和信號傳導(dǎo)密切相關(guān)。窖蛋白-1（caveolin-1）是胞膜窖的主要結(jié)構(gòu)成分，在細(xì)胞內(nèi)吞、膽固醇運輸、信號傳導(dǎo)、腫瘤轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著重要的作用。Caveolin-1（Cav-1）在腫瘤中是發(fā)揮抑癌作用還是促癌作用一直存在爭論。在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞如乳腺癌、肺癌、卵巢癌中發(fā)揮抑癌基因樣作用，而在少數(shù)腫瘤如前列腺癌中則發(fā)揮癌基因樣作用。然而目前對Cav-1在肝癌細(xì)胞中所發(fā)揮作用的研究尚

2、少，對于Cav-1介導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機制亦不十分清楚。 前期研究結(jié)果表明，Cav-1在小鼠肝癌細(xì)胞Hca-F和Hca-P中呈高表達(dá)，且前者高于后者，在Hepa1-6細(xì)胞中表達(dá)缺失。其中Hca-F具有高侵襲、高淋巴道轉(zhuǎn)移潛能，Hca-P具有低侵襲、低淋巴道轉(zhuǎn)移潛能，Hepa1-6無轉(zhuǎn)移潛能。因此推測，Cav-1的表達(dá)可能在小鼠肝癌細(xì)胞惡性表型轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用。大量的實驗已經(jīng)表明，腫瘤細(xì)胞的惡性行為很大程度上是由細(xì)

3、胞表面形成過量的β1，6G1cNAc分支結(jié)構(gòu)，進(jìn)而產(chǎn)生多天線的N-糖鏈結(jié)構(gòu)，從而改變了糖蛋白分子的生物學(xué)性狀，使腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為發(fā)生改變。然而，Cav-1是否影響小鼠肝癌細(xì)胞N-糖蛋白的β1，6G1cNAc分支結(jié)構(gòu)，有關(guān)報道較少。 CD147，又稱基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)物（EMMPRIN），是屬于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白，由于N-糖基化程度的不同，表現(xiàn)為分子量不同的高糖型（HG-CD147）和低糖型（LG-CD147）。已

4、有研究證實，CD147在許多惡性腫瘤細(xì)胞中有表達(dá)，并能誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶產(chǎn)生，從而影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。 前期研究結(jié)果顯示，HG-CD147和LG-CD147在小鼠肝癌細(xì)胞Hca-F，Hca-P和Hepa1-6中均有表達(dá)，且Hca-F細(xì)胞的表達(dá)強度明顯高于Hca-P和Hepa1-6細(xì)胞。此外，Cav-1的表達(dá)有利于LG-CD147向HG-CD147的轉(zhuǎn)化。然而，CD147在不同淋巴道轉(zhuǎn)移潛能的小鼠肝癌細(xì)胞株中的糖鏈結(jié)構(gòu)如何，

5、Cav-1表達(dá)是否對CD147糖蛋白糖鏈的分支結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響，Cav-1如何調(diào)節(jié)CD147的糖基化，有關(guān)報道甚少。 本文在利用分子克隆、基因轉(zhuǎn)染及RNA干擾等技術(shù)上調(diào)和下調(diào)Cav-1表達(dá)的基礎(chǔ)上，1）觀察Cav-1表達(dá)變化對小鼠肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的影響；2）闡明Cav-1介導(dǎo)小鼠肝癌細(xì)胞凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機制；3）分析CD147在小鼠肝癌細(xì)胞株中的糖型結(jié)構(gòu)，并初步探討Cav-1對N-糖蛋白分支結(jié)構(gòu)的調(diào)

6、節(jié)作用。本研究實驗結(jié)果如下： 1．pEGFP-N2/Cav-1表達(dá)載體構(gòu)建及在小鼠肝癌Hepa1-6細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá) 利用RT-PCR從小鼠肺組織總RNA中成功克隆出546bp的Cav-1cDNA的24-557bp片斷，重組陽性克隆經(jīng)酶切和測序鑒定證實目的基因已正確插入pEGFP-N2表達(dá)載體中，且與載體上的GFP基因處于同一開放閱讀框，記為pEGFP-N2/Cav-1。 利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，G418篩選獲得2個

7、穩(wěn)定表達(dá)外源Cav-1的Hepa1-6細(xì)胞株，記為Hepa1-6/Cav-1。RT-PCR和Western-blot方法證實，外源Cav-1基因整合到Hepa1-6細(xì)胞基因組中。免疫細(xì)胞化學(xué)和電鏡結(jié)果顯示，Cav-1在Hepa1-6細(xì)胞胞膜和胞漿中均有表達(dá)。 2．Cav-1表達(dá)上調(diào)或下調(diào)對小鼠肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化及凋亡的影響 軟瓊脂克隆形成實驗和體內(nèi)致瘤實驗結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染空載體組細(xì)胞（Hepa1-6/mock）和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞H

8、epa1-6比較，Hepa1-6/Cav-1組細(xì)胞集落形成數(shù)和體內(nèi)成瘤能力明顯增加（P<0．05）。 RT-PCR和Western-blot結(jié)果顯示，與scrambled siRNA和unrelated siRNA（control-siRNA）相比，Cav-1特異性siRNA（Cav-1-siRNA）能夠有效下調(diào)Cav-1在小鼠肝癌H22細(xì)胞中的表達(dá)，并可持續(xù)至轉(zhuǎn)染后3周左右。致瘤實驗和TUNEL實驗結(jié)果顯示，與對照組細(xì)胞相比

9、，Cav-1-siRNA轉(zhuǎn)染的H22細(xì)胞（H22/Cav-1-siRNA）在軟瓊脂中的克隆形成數(shù)明顯減少，體內(nèi)成瘤能力下降，凋亡數(shù)增多。 3．Cav-1在放線菌素D誘導(dǎo)小鼠肝癌細(xì)胞凋亡中的作用及分子機制 Hoechst33342染色結(jié)果顯示，放線菌素D可誘導(dǎo)小鼠肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，呈時間和濃度依賴性。TUNEL結(jié)果顯示，Cav-1過表達(dá)減少放線菌素D誘導(dǎo)的Hepa1-6細(xì)胞凋亡數(shù)目；Cav-1下調(diào)增加Hca-F細(xì)胞凋亡數(shù)

10、目，并增強Hca-F細(xì)胞對放線菌素D的敏感性。 Western-blot結(jié)果顯示，Cav-1過表達(dá)上調(diào)survivin蛋白水平，降低活性caspase-3（active caspase-3）表達(dá)；Cav-1表達(dá)沉默降低survivin蛋白水平，升高active caspase-3表達(dá)。 4．Cav-1對小鼠肝癌細(xì)胞N-聚糖β1，6G1cNAc分支的調(diào)節(jié) PHA-L Lectin-blot結(jié)果顯示，當(dāng)Cav-1

11、表達(dá)沉默時，H22細(xì)胞總蛋白與PHA-L的結(jié)合信號減弱，β1，6G1cNAc分支形成受抑制；當(dāng)Cav-1過表達(dá)時，Hepa1-6細(xì)胞總蛋白與PHA-L的結(jié)合信號增強，β1，6G1cNAc分支形成增加?；|(zhì)膠侵襲實驗和體內(nèi)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移實驗結(jié)果顯示，β1，6G1cNAc分支減少可抑制H22細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，β1，6G1cNAc分支增多可增強Hepa1-6細(xì)胞的侵襲能力。 糖苷酶酶切實驗結(jié)果顯示，在小鼠肝癌Hca-F和Hepa1-6

12、細(xì)胞中CD147為N-糖蛋白，LG-CD147均為高甘露糖型，HG-CD147分別為雜合型和復(fù)合型。免疫共沉淀及Lectin-blot分析結(jié)果顯示，Cav-1過表達(dá)可增加CD147的平分型GlcNAc分支形成，而對β1，6G1cNAc分支無影響。 Real-time PCR結(jié)果顯示，Hepa1-6/Cav-1細(xì)胞中N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅲ（GnTⅢ）的mRNA表達(dá)水平較Hepa1-6中升高，GnTⅣ有所降低，GnTⅤ升高不