山楂原花青素抗氧化作用和對人肝癌細胞SMMC-7721細胞凋亡的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、山楂（Crataegus pinnatifida Bunge）果實酸甜可口，營養(yǎng)豐富，富含原花青素(proanthocyanidin，PC)等功能性成分。研究表明，原花青素是一類具有極強抗氧化作用的多酚化合物，從食物中攝取原花青素可以調(diào)節(jié)細胞凋亡、抗衰老，預(yù)防心血管、癌癥等疾病。探討山楂原花青素的抗肝癌活性，有望為肝癌患者的食療提供新的途徑。本試驗研究了山楂PC提取物及其主要成分對SMMC-7721人肝癌細胞的增殖抑制作用及其對抗氧化和

2、細胞凋亡的影響。主要研究內(nèi)容如下:
　　(1)用DPPH法和ABTS法檢測山楂PC提取物、表兒茶素和B2在體外清除自由基的能力。結(jié)果表明在濃度1-5μg/mL范圍內(nèi)，山楂PC提取物、表兒茶素和B2對DPPH自由基的清除率隨樣品濃度增加而增大;在10-50μg/mL范圍內(nèi)，山楂PC提取物、表兒茶素和B2對ABTS自由基的清除率隨樣品濃度增加而增大。對DPPH自由基清除率的IC50分別為山楂PC提取物3.19μg/mL，B210.70

3、μg/mL，表兒茶素13.01μg/mL;對ABTS自由基清除率的IC50分別為山楂PC提取物30.50μg/mL，B295.14μg/mL，表兒茶素120.02μg/mL。試驗證明山楂PC提取物、表兒茶素和B2對DPPH與ABTS自由基的清除率跟其濃度呈正相關(guān)，山楂PC提取物、表兒茶素和B2可顯著(p＜0.05)清除DPPH和ABTS自由基。
　　(2)MTT法測定山楂PC提取物、表兒茶素和B2對SMMC-7721人肝癌細胞增殖

4、的作用。試驗表明山楂PC提取物、表兒茶素和B2對細胞的增殖抑制率有一定不同，在低于25μg/mL時，B2對細胞的增殖抑制效果較好，在50μg/mL及100μg/mL濃度時，山楂PC提取物對細胞的增殖抑制效果最好。在100μg/mL處理濃度下，24h后山楂PC提取物、表兒茶素和B2對SMMC-7721人肝癌細胞的增殖抑制率分別為39.19％、24.60％和25.75％;48h后山楂PC提取物、表兒茶素和B2對細胞的增殖抑制率分別為68.0

5、9％、52.07％和58.04％。同濃度同時間處理條件下，山楂PC提取物、表兒茶素和B2對HL-7702人正常肝細胞生長活力無明顯影響。上述結(jié)果證明原花青素呈時間和濃度依賴性顯著（p＜0.05）抑制SMMC-7721人肝癌細胞的增殖。
　　(3)以形態(tài)觀察，DAPI染色和Western Blot法研究山楂原花青素對肝癌細胞的凋亡作用。山楂PC提取物、表兒茶素和B2處理SMMC-7721人肝癌細胞48h后，觀察細胞形態(tài)，結(jié)果原花青素

6、可誘導(dǎo)SMMC-7721人肝癌細胞發(fā)生凋亡，使細胞產(chǎn)生貼壁不牢，邊緣變圓，體積變小，數(shù)量減少，產(chǎn)生凋亡小體的凋亡形態(tài)。同時細胞出現(xiàn)細胞核固縮，細胞膜通透性改變的現(xiàn)象，DAPI染色后，熒光顯微鏡下拍照觀察，凋亡細胞顯示出明亮的藍色熒光。Western Blot法檢測SMMC-7721人肝癌細胞中相關(guān)凋亡蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)山楂PC提取物、表兒茶素和B2可以既通過激活Caspase-8，進而激活Caspase-3，使PARP片段化，誘導(dǎo)SMMC

7、-7721細胞發(fā)生由死亡受體調(diào)節(jié)的細胞外源凋亡途徑，也可以通過增加促凋亡蛋白Bax表達，降低抑凋亡蛋白Bcl-2表達，從而增加Bax與Bcl-2的比值，進而激活Caspase-3，使PARP片段化，誘導(dǎo)SMMC-7721細胞發(fā)生由線粒體調(diào)節(jié)的細胞內(nèi)源凋亡途徑。同時，山楂PC提取物、表兒茶素和B2可以增加抑癌基因p53的量，從而誘導(dǎo)SMMC-7721細胞發(fā)生凋亡。試驗證明，山楂原花青素可以誘導(dǎo)SMMC-7721人肝癌細胞凋亡。
　　

8、(4)對山楂原花青素處理過的細胞中MDA含量和相關(guān)酶活進行測定，結(jié)果表明，山楂PC提取物、表兒茶素和B2可以呈濃度依賴性的使SMMC-7721人肝癌細胞中SOD、CAT、GSH-Px和Na+K+-ATP酶活性降低，增加MDA的量(p＜0.05)，從而使細胞抗氧化體統(tǒng)紊亂，進而誘導(dǎo)細胞凋亡。其中，山楂PC提取物對SMMC-7721人肝癌細胞MDA、抗氧化酶和ATP酶的影響最大。
　　山楂中富含原花青素，山楂原花青素的抗癌作用將為肝癌