基因重組菌高效表達p53C蛋白及色譜純化.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、p53蛋白是人體內(nèi)的重要的癌癥抑制劑之一,也是細胞在應(yīng)激狀態(tài)下必備的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。因此,應(yīng)用基因工程技術(shù)在體外高效表達p53蛋白以及對其分離純化方法的建立,一直是近年來抗癌藥物研究領(lǐng)域的熱點之一。
  本文首先設(shè)計構(gòu)建了表達p53目標蛋白的基因重組菌。p53C是p53蛋白第94-312位氨基酸之間的序列,涵蓋了p53的整個DNA結(jié)合區(qū)域,p53中超過85%的錯義突變都可以定位到這一核心區(qū)域中。為此,設(shè)計將p53C基因片段插入到pR

2、SET(A)質(zhì)粒載體上,再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中,獲得了能夠?qū)δ繕说鞍譸53C進行外源表達的基因重組菌;并進一步對培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化,主要考察了誘導時機、誘導時間、誘導劑濃度對基因重組菌表達目標蛋白p53C的影響。實驗結(jié)果表明,誘導時機控制在細菌生長的對數(shù)生長前期,誘導時間8h,誘導劑濃度1mmol/L的最佳培養(yǎng)條件下,可實現(xiàn)目標蛋白p53C的高效表達;最后,采用SP-Sepharose陽離子交換

3、色譜對含有 p53C蛋白的細胞破碎上清液進行分離純化,并對比了不同操作條件對純化效果的影響。結(jié)果表明,采用階躍梯度洗脫,在80%的鹽濃度下,可達到良好的純化效果,目標蛋白的純度提高至21.2%。在pH8.0的色譜操作條件下,目標蛋白收率最高,純度也較高達21.8%。此外初步嘗試了陰離子交換色譜、凝膠色譜和親和色譜,但對目標蛋白p53C的分離效果均不佳,有待于對操作條件和方法的進一步完善和確定。
  本研究建立了基因重組菌對p53C

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