神經(jīng)管畸形鼠神經(jīng)干細胞特性及葉酸對其干預(yù)作用的研究.pdf

1、目的：
　　研究以全反式維甲酸誘導(dǎo)構(gòu)建的神經(jīng)管畸形SD胎鼠生長發(fā)育、脊髓神經(jīng)干細胞生物學(xué)特性及H3K27me3的變化與葉酸對其干預(yù)作用之間的關(guān)系。探討神經(jīng)管畸形發(fā)生及葉酸干預(yù)作用的機制，為神經(jīng)管畸形的防治提供更為可靠的理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.動物模型的建立：將性成熟健康雌鼠隨機分為①正常組，②致畸組，③致畸葉酸干預(yù)組。其中③致畸葉酸干預(yù)組，于交配前兩周開始飼喂含葉酸大鼠顆粒飼料至剖宮取胎；②致畸組、③致畸葉酸干

2、預(yù)組于E10d天時，按100mg/kg一次性給予濃度為40mg/ml的的ATRA，①正常組予同樣體積的橄欖油。于E15 d時剖宮取胎，觀察胎鼠大體形態(tài)，并記錄數(shù)量、身長、體重及畸形類型。
　　2.病理學(xué)觀察：取明顯神經(jīng)管畸形的胎鼠及正常胎鼠相同部位組織，包埋蠟塊進行HE染色，顯微鏡下觀察其病理學(xué)變化。
　　3.脊髓神經(jīng)干細胞分離培養(yǎng)：取三組E15 d胚胎的脊髓，分離培養(yǎng)其中的神經(jīng)干細胞，觀察各組中神經(jīng)干細胞的比例、生長活性以

3、及分化特性的變化。
　　4.各組神經(jīng)干細胞中H3K27me3表達檢測：通過免疫細胞學(xué)技術(shù)定性判斷三組神經(jīng)干細胞中H3K27me3的表達，并通過Western blot技術(shù)定量分析H3K27me3在三組細胞核中的表達量。
　　結(jié)果：
　　1.①正常組共獲得胎鼠117只，其中死胎一只，其余均活胎，外觀無明顯畸形；②致畸組其中死胎或吸收胎12只，活胎93只，顯性脊柱裂45.2％(42/93)，無尾、環(huán)尾或短尾畸形66.7%(

4、62/93)，足畸形22.6%(21/93)，無腦及腦膨出等畸形8.6%(8/93)；③致畸葉酸干預(yù)組其中死胎或吸收胎7只，活胎106只，顯性脊柱裂26.4%(28/106)，無尾、環(huán)尾或短尾畸形42.5%(45/106)，足畸形11.3%(12/106)，無腦及腦膨出等畸形5.7%(6/106)。對照組共獲得胎鼠125只，②組較①組發(fā)育差，身長、體重經(jīng)t檢驗分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），③組較②組發(fā)育好，差異有統(tǒng)計學(xué)意義

5、r>　　2.病理觀察發(fā)現(xiàn)正常胎鼠可觀察到脊髓形態(tài)正常，椎體錐弓發(fā)育良好，被覆皮膚連續(xù)，E15d胎鼠神經(jīng)管基本閉合，中央管形態(tài)規(guī)則。顯性脊柱裂胎鼠脊髓改變復(fù)雜，脊柱背側(cè)（位置較致畸葉酸干預(yù)組高）被覆皮膚不連續(xù)，組織缺損，沿脊柱縱軸呈現(xiàn)一個橢圓形缺損區(qū),長約0.3～0.4 cm（范圍較致畸葉酸干預(yù)組大），深部脊髓組織缺失、形態(tài)改變，脊髓脊膜向外膨出，多有炎性細胞浸潤，自尾側(cè)向頭側(cè)，尾側(cè)端見到完全紊亂多極性排列的神經(jīng)管上皮形成多個管狀結(jié)構(gòu)混亂

6、排列，形成神經(jīng)組織錯構(gòu)腫瘤。
　　3.免疫細胞化學(xué)顯示所獲得細胞Nestin陽性，并可誘導(dǎo)分化出GFAP、NSE陽性細胞，具有NSCs特性。①正常組，②致畸組，③致畸葉酸干預(yù)組鏡下神經(jīng)球計數(shù)分別為：29.4±2.07、17.8±2.17、23.4±1.52（P<0.05），直徑：140.2±4.82、106.6±3.85、121.8±4.09（P<0.05）；誘導(dǎo)分化后Nestin表達量分別為：（6±0.9）%、（21±4）%、（

7、32±3）%（P<0.05）；免疫細胞化學(xué)顯示三組神經(jīng)干細胞中均有H3K27me3表達，Western blot結(jié)果顯示畸形組中H3K27me3明顯較正常組高表達，葉酸干預(yù)組較其表達下調(diào)（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.全反式維甲酸可以誘導(dǎo)多種神經(jīng)管畸形的發(fā)生；
　　2.神經(jīng)管畸形鼠生長發(fā)育遲緩，葉酸能夠有效改善這一現(xiàn)象；
　　3.無血清培養(yǎng)條件下脊髓源性神經(jīng)干細胞生長良好，保持了干細胞特性；
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