下調(diào)Cullin7抑制乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移及其分子機(jī)制的研究.pdf

1、背景：乳腺癌在世界范圍內(nèi)是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。乳腺癌患者一旦發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，生存率將明顯下降。探討乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，是目前乳腺癌研究的熱點(diǎn)之一。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變（Epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）是指上皮細(xì)胞形態(tài)向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變，通過 EMT腫瘤細(xì)胞獲得遷移運(yùn)動能力，業(yè)已證明 EMT與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
　　當(dāng)前已有大量研究證實(shí)，Cullin7

2、與肺癌、肝癌及黑色素細(xì)胞瘤等惡性腫瘤的形成密切相關(guān)，在前期研究中，我們通過外顯子測序法篩選出乳腺轉(zhuǎn)移候選基因Cullin7，在后續(xù)研究中利用免疫組化法在蛋白水平證實(shí)Cullin7對乳腺癌發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的有促進(jìn)作用，但Cullin7如何引起乳腺癌發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，目前仍未有相關(guān)明確的報告。研究表明泛素化蛋白酶系統(tǒng)的紊亂與腫瘤的形成密切相關(guān)，Cullin蛋白作為泛素化蛋白酶E3 Skp-Cullin-F-box（SCF）的重要組成結(jié)構(gòu)，它

3、能特異性識別底物，介導(dǎo)蛋白質(zhì)泛素化過程。Cullin家族成員包括 Cullin1、Cullin2、Cullin3、Cullin4A、Cullin4B、Cullin5和Cullin7，Cullin7作為 Cullin家族的一員，它與Skp1，F(xiàn)bx29和Roc1構(gòu)成E3復(fù)合物，參與細(xì)胞間信號傳導(dǎo)、細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞增殖及凋亡等過程。與 Cullin7擁有相似結(jié)構(gòu)和功能的Cullin4A表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致乳腺癌的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT，Epith

4、elial-Mesenchymal Transition），我們假設(shè)在Cullin7也存在著類似促轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制在乳腺癌轉(zhuǎn)移中扮演的角色。
　　本實(shí)驗(yàn)將利用半定量RT-PCR技術(shù)測定在乳腺癌患者的正常組織、腫瘤原發(fā)病灶和腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病灶中Cullin7的mRNA表達(dá)量；利用瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)、半定量RT-PCR技術(shù)和細(xì)胞劃痕、遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)探討Cullin7基因與腫瘤侵襲遷移能力的關(guān)系；最后，運(yùn)用半定量RT-PCR和Western B

5、lot技術(shù)探討Cullin7基因與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的EMT信號通路下游靶基因的關(guān)系，在不同研究水平上探討Cullin7通過調(diào)控EMT信號通路影響乳腺癌轉(zhuǎn)移的可能。
　　目的：在轉(zhuǎn)錄水平研究Cullin7基因與乳腺癌發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的關(guān)系，用乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435s作用實(shí)驗(yàn)物探討Cullin基因影響機(jī)制，細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移行為關(guān)系，以及研究其分子生物學(xué)機(jī)制，在mRNA和蛋白質(zhì)、細(xì)胞和分子水平證實(shí)Cullin7基因可能通過調(diào)控EMT

6、通路對乳腺癌侵襲促進(jìn)轉(zhuǎn)移的作用以及可能機(jī)制。
　　材料和方法：
　　1.標(biāo)本和細(xì)胞
　　收集廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺腫瘤外科2011年7月~2013年7月期間經(jīng)我院病理確診并行手術(shù)治療標(biāo)本，正常乳腺組織13例，取自乳腺癌患者患側(cè)乳房的正常乳腺組織，乳腺浸潤性癌68例，包括浸潤性潤性導(dǎo)管癌57例，浸潤性小葉癌4例，特殊型浸潤性導(dǎo)管癌7例（髓樣癌4例，粘液腺癌3例）?；颊呔鶠榕?，年齡30-86歲之間，平均51.6歲，

7、中位年齡50.5歲。其中乳腺癌患者，≤50歲34例，>50歲34例。Ⅰ期：19例，ⅡA期：8例，ⅡB期：13例，ⅢA期：11例，ⅢB期：3例，ⅢC期：14例。39例已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，29例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行化療、放療及內(nèi)分泌治療。人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、 MDA-MB-435s、MCF-7、SK-BR-3、BT549及BT-474均購買于美國ATCC公司，復(fù)蘇后培養(yǎng)2~3代用于本實(shí)驗(yàn)。
　　2.方法

8、r>　　2.1采用半定量 RT-PCR法檢測乳腺癌患者正常組織、原發(fā)病灶以及腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中Cullin7 mRNA的表達(dá)量，分析各組織中Cullin7 mRNA表達(dá)的差異，并探討Cullin7 mRNA與乳腺癌患者臨床病例特征、免疫組化以及臨床因素的關(guān)系，采用兩組或多組獨(dú)立樣本的Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)分析了不同乳腺組織中Cullin7 mRNA表達(dá)差異；相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義

9、。
　　2.2采用半定量RT-PCR法檢測乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MDA-MB-435s、MCF-7、SK-BR-3、BT549及BT-474中Cullin7、E-cadherin、Vimentin和GAPDH mRNA表達(dá)水平，采用瞬時轉(zhuǎn)染法將Cullin7 siRNA轉(zhuǎn)染至人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435s，并篩選出低表達(dá)Cullin7的細(xì)胞株。利用倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)的改變，并使用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞侵襲和

10、遷移實(shí)驗(yàn)明確Cullin7對人乳腺癌細(xì)胞體外遷移運(yùn)動和侵襲能力的影響。
　　2.3采用半定量RT-PCR和Western Blot法檢測人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435s在Cullin7 siRNA轉(zhuǎn)染后EMT信號通路相關(guān)分子的表達(dá)情況，以探討Cullin7對EMT信號通路的調(diào)控作用。
　　結(jié)果：
　　1. Cullin7 mRNA在乳腺癌患者正常組織、乳腺癌患者癌組織及和乳腺癌患者腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)水平分別為

11、1.2836±0.39839、1.8430±0.86894、2.2962±0.80598，表明Cullin7在乳腺癌患者癌組織和腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶內(nèi)的表達(dá)明顯高于乳腺癌患者的正常組織，且在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶內(nèi)升高更明顯。另外，乳腺癌患者癌組織Cullin7 mRNA的表達(dá)水平與有無家族病史呈正相關(guān)（p≤0.05）。乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的 Cullin7 mRNA表達(dá)水平與淋巴結(jié)分期呈正相關(guān)（p≤0.05）。
　　2.利用Cullin7

12、siRNA轉(zhuǎn)染得到低表達(dá)Cullin7的人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435s，siRNA與陰性對照組相比，MDA-MB-435s/siRNA細(xì)胞形態(tài)從間質(zhì)型逆轉(zhuǎn)為上皮型，體外遷移運(yùn)動和侵襲能力明顯降低。
　　3.RT-PCR結(jié)果顯示MDA-MB-435s/siRNA細(xì)胞中EMT通路轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug、Twist和Zeb-2表達(dá)明顯下降(P<0.01)，間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)；Weste

13、rn Blotting結(jié)果表明EMT通路轉(zhuǎn)錄因子Snail和Slug蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.01)，間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin和N-cadherin的蛋白水平明顯下調(diào)(分別為P<0.01和P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.乳腺癌患者腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中Cullin7 mRNA的表達(dá)水平顯著高于乳腺癌患者癌組織和乳腺癌患者正常組織，乳腺癌患者癌組織顯著高于乳腺癌患者正常組織。這提示Cullin7 mRNA高表達(dá)在乳腺癌的形

14、成和轉(zhuǎn)移中起促進(jìn)作用，提示 Cullin7有可能作為乳腺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)候選基因。另外，乳腺癌患者癌組織Cullin7 mRNA的表達(dá)水平與有家族病史呈正相關(guān)。乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的Cullin7 mRNA表達(dá)水平與淋巴結(jié)分期呈正相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Cullin7高表達(dá)人群患乳腺癌的風(fēng)險高于普通人群，也提示了Cullin7高表達(dá)乳腺癌患者擁有較差的預(yù)后。
　　2.通過RNA干擾方法使Cullin7基因表達(dá)下調(diào)，在體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)染后腫瘤