三個CTV弱毒分離株的拮抗效果研究.pdf

1、由柑橘衰退病毒引起的柑橘衰退病是世界范圍內(nèi)最具經(jīng)濟重要性的柑橘病害。應(yīng)用弱毒系交叉保護(MSCP)是防治莖陷點型柑橘衰退病的有效方法之一。因此，研究CTV弱毒分離株對我國強毒株系的拮抗作用并對其效果進行評價，是篩選具有MSCP應(yīng)用價值的CTV弱毒分離株的重要環(huán)節(jié)。本文通過CTV弱毒分離株對強毒分離株的拮抗試驗，篩選出拮抗作用強的弱毒株系，可為我國應(yīng)用MSCP防治柑橘衰退病的打下一定的基礎(chǔ)。 本文首先對中國農(nóng)科院柑橘研究所國家柑橘

2、苗木脫毒中心收集的CTV弱毒分離株CT10、CT12、CT17和強毒分離株CT4的p20、p23、p25三個基因RT-PCR產(chǎn)物進行HinfⅠ/RFLP分析，其次對這三個基因測序后進行了酶切位點分析和同源性分析，同時應(yīng)用四對引物對供試毒源基因組5’基因片段進行RT-PCR分析，以達到區(qū)分強、弱毒分離株系的目的。應(yīng)用上述方法結(jié)合莖陷點癥狀分析，對3個CTV弱毒分離株與強毒分離株CT4之間的拮抗效果進行了評估。此外，還比較了9個保存在新會橙

3、上的CTV分離株嫁接接種到鳳凰柚前后p25基因的HinfⅠRFLP和SSCP變化情況。研究結(jié)果如下： 1)通過酶切發(fā)現(xiàn)CTV強毒分離株CT4是以p25HinfⅠRFLP第Ⅲ組群為主的p25/HinfⅠRFLP第Ⅰ、第Ⅲ組群的混合株系，弱毒分離株CT17與弱毒分離株CT12均屬p25/HinfⅠRFLP第Ⅰ組群，弱毒分離株CT10屬p25/HinfⅠRFLP第Ⅳ組群。對p20基因的HinfⅠRFLP分析表明，CT10不能被酶切；C

4、T12、CT17的p20/HinfⅠRFLP譜帶相同，均有約180bp、約370bp的DNA條帶；CT4的酶切譜帶具有約100bp、約180bp、約280bp、約370bp的4條DNA條帶。 2)對供試的4個CTV分離株的p20、p23和p25基因序列同源性分析表明在CT10、CT12和CT17三個弱毒分離株中CT17與強毒分離株CT4同源性最高。 3)RT-PCR分析表明用引物T305’(f，r)和引物T30K17(f

5、,r)進行RT-PCR均可將CTV強毒分離株CT4與弱毒分離株CT17、CT12區(qū)分開。 4)通過本試驗所建立的鑒別CTV強、弱毒株系的RFLP方法和其與RT-PCR相結(jié)合的方法，實現(xiàn)了對CT4強毒分離株的定期分子監(jiān)控。 5)拮抗實驗中對CTV強毒分離株CT4的分子監(jiān)控表明，接種強毒分離株后1個月、3個月、5個月和8個月，CTV強毒分離株CT4的檢出率在經(jīng)弱毒分離株CT10接種的植株分別為25％、50％、87.5％和10

6、0％；在經(jīng)CT12接種的植株分別為40％、50％、80％和80％；在經(jīng)CT17接種的植株分別為9.1％、27.3％、35.4％和45.6％。三個CTV弱毒分離株均減少或延遲了強毒分離株CT4的檢出，對CT4均表現(xiàn)一定拮抗作用，其中CT17的拮抗效果最好。莖陷點癥狀的分析結(jié)果與分子檢測結(jié)果一致。 6)9個保存在新會橙上的CTV分離株嫁接接種到鳳凰柚的p25基因的HinfⅠRFLP和SSCP變化情況的比較試驗，結(jié)果表明有7個分離株R