miRNA-100在膀胱尿路上皮癌發(fā)生發(fā)展中的抑制作用及機制研究.pdf

1、[背景]：
　　 膀胱癌是我國發(fā)病率最高的泌尿系統(tǒng)腫瘤，是一種直接威脅患者生存的疾病。世界范圍內(nèi)，膀胱癌發(fā)病率居惡性腫瘤的第九位，在男性排名第六位，女性排在第十位之后。男女患病率約為3:1。據(jù)統(tǒng)計，2011年世界膀胱癌新發(fā)病例數(shù)達到69250例，因患膀胱癌死亡人數(shù)居總體因腫瘤死亡人數(shù)的第8位。大約90％的膀胱癌屬上皮細胞源性的，且絕大部分為尿路上皮細胞癌。膀胱癌可分為非肌層浸潤性膀胱癌(Tis，Ta，T1)和肌層浸潤性膀胱癌(T

2、2以上)。非肌層浸潤性膀胱癌具有多相群的特點，包括了從良性的腫瘤，到極少發(fā)生進展的非浸潤性的乳頭狀瘤，以及到乳頭狀生長的侵襲粘膜下層的腫瘤，該類型可有多達60％的進展率。膀胱癌的腫瘤分級也是一個重要的預(yù)后相關(guān)因子。低級別的分化良好，高級別的分化差、容易進展。目前，對膀胱癌發(fā)生發(fā)展的機制尚未充分的闡明。為了探尋更好的膀胱癌診斷和治療的有效方法，有必要進一步研究其發(fā)病機制。
　　 microRNA(miRNA)是一類小RNA(約20

3、-22個堿基)，它們通過與靶信使RNA(mRNA)的堿基互補，根據(jù)互補程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。迄今為止，人類基因組中發(fā)現(xiàn)了1527個miRNA((http://www.mirbase.org/)，據(jù)預(yù)測，miRNA可能調(diào)控人類所有的基因翻譯。近年來研究證實人類microRNA是腫瘤狀態(tài)的發(fā)展與維持中的重要因子，它們存在于腫瘤相關(guān)基因組區(qū)域，扮演者腫瘤抑癌基因或癌基因的角色。膀胱腫瘤的發(fā)生機制研究中

4、，microRNA水平的研究近年也漸有文獻報道，如miR-125b，-133a，-143，-218和-221等，這些miRNA都和膀胱癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。但這些報道依然缺乏良好的系統(tǒng)性和一致性。如今，如果能利用基因芯片技術(shù)進行高通量篩選，進一步研究明確miRNA在膀胱癌疾病進展中的基因調(diào)節(jié)體系，建立與膀胱腫瘤進展高度相關(guān)的miRNAs系列簇，無疑對膀胱癌的預(yù)測、早期診斷、及時治療、實現(xiàn)基因治療和術(shù)后預(yù)后判斷提供很好的理論依據(jù)和實現(xiàn)新的治療

5、技術(shù)革新。
　　 最近報道提示miR-100在低級別的膀胱癌組織中表達下調(diào)，然而，它的生物學(xué)功能未見深入的研究和探索。同時，在針對其他腫瘤的研究中，miR-100的功能特點存在較大的差異，其在急性髓性白血病中是癌基因，而在宮頸癌中則是抑癌基因。本研究是在前期實施miRNA芯片預(yù)實驗行膀胱癌組織miRNA表達差異高通量篩選的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)miR-100在各個分期和分級的膀胱癌組織中是低表達的。我們將重點探索miR-100在在膀胱尿路

6、上皮癌發(fā)生發(fā)展中的抑制作用及機制。
　　 [目的]：
　　 探討miR-100在膀胱尿路上皮癌發(fā)生發(fā)展中的抑制作用及機制，為miR-100成為膀胱癌預(yù)后判斷和治療靶點奠定理論基礎(chǔ)。
　　 [材料和方法]：
　　 1.組織樣本和細胞株的準備。共收集膀胱癌成對組織樣本77例，9個膀胱癌細胞株及建立1株原代膀胱癌細胞系。
　　 2.microRNA芯片實驗。選用10例膀胱癌樣本，實施20張miRNA芯片

7、實驗。
　　 3.利用Realtime-PCR技術(shù)，對miRNA芯片實驗得到的差異microRNA在擴大樣本量膀胱癌樣本中進行驗證，比較分析，明確穩(wěn)定且表達差異顯著的3-4個microRNA。結(jié)合文獻參考、分析歸納，確認下一步研究miR-100。
　　 4.質(zhì)粒構(gòu)建、慢病毒包裝和轉(zhuǎn)染。miR-100前體模擬物、抑制體及對照RNA的合成。
　　 5.miR-100過表達或抑制后細胞表型的變化。包括細胞增殖、克隆形成

8、、遷移和侵襲能力的相關(guān)實驗。
　　 6.運用流式細胞技術(shù)檢測細胞生長變化中細胞周期和凋亡情況變化。
　　 7.裸鼠膀胱癌成瘤模型的建立和驗證實驗。采用皮下種植膀胱癌EJ細胞，膀胱內(nèi)原位種植膀胱癌5637細胞兩種體內(nèi)實驗?zāi)Ｐ汀?br>　　 8.原代膀胱癌細胞株和裸鼠膀胱癌轉(zhuǎn)移模型的建立和驗證。建立一株浸潤性強的膀胱原代細胞921T，并運用該細胞成功構(gòu)建裸鼠膀胱癌轉(zhuǎn)移模型，驗證miR-100及其靶基因與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

9、。
　　 9.生物信息學(xué)分析研究，行GO分析和Pathway分析，構(gòu)建miR-target-network，尋找miR-100的直接靶基因。
　　 10.qRT-PCR、雙熒光素酶報告基因檢測、WesternBlot靶基因?qū)嶒烌炞C。
　　 11.統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 [結(jié)果]：
　　 1.分析芯片實驗數(shù)據(jù)表明，20個miRNA在非肌層浸潤性的膀胱癌組織中存在明顯差異表達，而22個在肌層浸潤性癌中明顯

10、差異表達。二者有10個miRNA的交集。擴大樣本67例行qRT-PCR實驗驗證，發(fā)現(xiàn)miR-100和-145在癌中穩(wěn)定下調(diào)而miR-182則穩(wěn)定上調(diào)。其中miR-100表現(xiàn)最為明顯。
　　 2.體外和體內(nèi)實驗均表明，miR-100能抑制膀胱癌細胞的增殖。CCK-8檢測法和克隆形成實驗均提示，miR-100的過表達能抑制體外細胞的增殖能力，而抑制胞內(nèi)miR-100的水平則促進細胞的生長。該現(xiàn)象在皮下種植和膀胱原位種植受慢病毒Len

11、ti-miR-100侵染的膀胱癌EJ/5637細胞成瘤生長實驗中得到驗證。
　　 3.mTOR是miR-100的直接靶基因。生物信息學(xué)手段提示mTOR是miR-100的直接靶點之一。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測證實miR-100能直接結(jié)合于mTOR的3’UTR區(qū)。二者在9個膀胱癌細胞系的表達差異呈現(xiàn)負相關(guān)。Westernblot和qRT-PCR實驗驗證miR-100的過表達能在mRNA和蛋白水平抑制mTOR的表達。
　　

12、4.miR-100能起到類似于si-mTOR的作用，其過表達能使EJ或5637細胞周期產(chǎn)生G1期阻滯，而未有凋亡能力的改變；同時，慢病毒Lenti-miR-100侵染后的5637細胞能對化學(xué)藥物阿霉素更加敏感。
　　 5.miR-100過表達和si-mTOR均能抑制膀胱癌細胞的遷移和侵襲能力。
　　 6.腫瘤轉(zhuǎn)移模型成功構(gòu)建，分析膀胱癌轉(zhuǎn)移灶和原發(fā)灶組織的miR-100和mTOR及其下游基因p70S6K的表達情況，相對于

13、原位的膀胱腫瘤，遠處轉(zhuǎn)移灶組織中miR-100的表達水平更低，而mTOR則上調(diào)。
　　 [結(jié)論]：
　　 1.miR-100在膀胱癌組織中普遍低表達。提示該基因為膀胱癌的抑癌基因，且在各個分期或分級的膀胱癌中均能穩(wěn)定下調(diào)。
　　 2.調(diào)節(jié)miR-100在膀胱癌細胞內(nèi)的表達水平能相應(yīng)改變膀胱癌細胞惡性表型，包括：過表達能抑制EJ、5637細胞進入S期而降低細胞的增殖能力；抑制細胞的遷移、侵襲能力；減弱EJ、5637

14、細胞體內(nèi)成瘤能力。而抑制該基因的表達則能促進細胞的增殖、侵襲能表型變化。結(jié)果提示miR-100的表達與膀胱癌細胞的活性負相關(guān)，有望成為膀胱癌基因治療的有效分子。
　　 3.mTOR基因及其所在信號通路是目前腫瘤病理機制研究的熱點，而我們發(fā)現(xiàn)該基因恰是miR-100的直接靶點之一。充分實驗證實，miR-100的過表達能抑制mTOR的表達水平。Si-mTOR介導(dǎo)的mTOR表達沉默能有相似的細胞表型變化。表明miR-100可能通過mT

15、OR信號通路作用，影響細胞的生長。
　　 4.膀胱癌裸鼠遠處轉(zhuǎn)移模型的研究成果提示miR-100可能作為膀胱癌遠處轉(zhuǎn)移、預(yù)后的預(yù)測因子和潛在的治療靶點。該結(jié)果值得后續(xù)臨床樣本進一步驗證和總結(jié)。
　　 總之，miR-100參與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展，是膀胱癌疾病發(fā)生和進展的重要調(diào)節(jié)因子之一，其表達的恢復(fù)有利于膀胱癌細胞惡性表型的控制和阻抑；同時，miRNA-100直接調(diào)控靶基因mTOR，作用于mTOR信號通路，該通路對細胞的生