ANLN基因在膀胱尿路上皮癌中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、[背景]
　　膀胱癌是我國發(fā)病率最高的泌尿系統(tǒng)腫瘤，臨床上，近半數(shù)膀胱癌患者在確診時(shí)已處于中晚期，即腫瘤已發(fā)生浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，臨床治療效果很差。膀胱癌根據(jù)不同病理分期，可分為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer，NMIBC)以及肌層浸潤(rùn)性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer，MIBC)，NMIBC以經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)為主，而MIBC則為全膀胱根治性切

2、除加淋巴結(jié)清掃術(shù)。然而，膀胱癌患者術(shù)后預(yù)后差異極大，大約60％的NMIBC患者行經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)后會(huì)復(fù)發(fā)，而MIBC患者行全膀胱根治性切除術(shù)后仍有約50％患者發(fā)生局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，對(duì)于膀胱癌發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)基因的分子機(jī)制及其臨床腫瘤學(xué)意義的深入研究，有助于探索膀胱癌分子分型，實(shí)現(xiàn)膀胱癌個(gè)體化治療。
　　最新高通量測(cè)序手段、生物信息學(xué)分析等手段為深入研究膀胱腫瘤的發(fā)病機(jī)制提供良好的平臺(tái)，可以有效分析腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信

3、號(hào)通路和關(guān)鍵靶點(diǎn)，為腫瘤早期診斷、個(gè)體化治療提供可行的依據(jù)。目前對(duì)于國人的膀胱癌全基因組測(cè)序相關(guān)研究尚缺乏，為此我科室膀胱癌課題研究組自2011年即開始聯(lián)合深圳華大基因研究院，運(yùn)用第二代基因測(cè)序手段對(duì)膀胱癌發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了深入研究，探索膀胱癌發(fā)生及發(fā)展機(jī)制及尋找分子分型標(biāo)記物。
　　[目的]
　　通過第二代基因測(cè)序探索膀胱癌與配對(duì)正常尿路上皮差異表達(dá)分子，尋找與膀胱癌發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)的基因，探索其在膀胱癌分子分型中的作用及其

4、在膀胱癌中的生物學(xué)功能。
　　[材料與方法]
　　1.提取10例行膀胱癌根治術(shù)患者膀胱癌組織及其配對(duì)的癌旁正常尿路上皮行轉(zhuǎn)錄組二代基因測(cè)序。通過生物信息學(xué)分析結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，篩選出候選基因行進(jìn)一步驗(yàn)證及功能探討。
　　2.抽提40對(duì)膀胱癌組織及配對(duì)正常尿路上皮組織RNA行qRT-PCR，檢驗(yàn)ANLN基因mRNA表達(dá)量，達(dá)并探索ANLN基因與膀胱癌分級(jí)、分期的關(guān)系。
　　3.通過公共測(cè)序信息數(shù)據(jù)庫GEO(Gene E

5、xpression Omnibus)及TCGA(TheCancer Genome Atlas，TCGA)行數(shù)據(jù)挖掘，驗(yàn)證其中ANLN基因表達(dá)量與膀胱癌病理分期及預(yù)后關(guān)系。
　　4.對(duì)209例膀胱癌患者的腫瘤組織石蠟切片行免疫組化染色方法，探討ANLN編碼蛋白Anillin的表達(dá)量，比較Anillin在膀胱腫瘤組織及正常尿路上皮中表達(dá)量差異。探討Anillin表達(dá)量與膀胱癌病理分級(jí)、分期關(guān)系及其與患者預(yù)后關(guān)系。
　　5.通過q

6、RT-PCR檢測(cè)7種膀胱癌細(xì)胞系A(chǔ)NLN基因mRNA表達(dá)量。采用瞬轉(zhuǎn)干擾RNA（siRNA）方法對(duì)ANLN基因高表達(dá)細(xì)胞系J82及5637行基因敲減，通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ANLN基因敲減對(duì)J82及5637細(xì)胞增殖能力影響。通過構(gòu)建慢病毒實(shí)現(xiàn)對(duì)J82細(xì)胞系A(chǔ)NLN基因的穩(wěn)定敲減。利用慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)J82細(xì)胞建立膀胱癌裸鼠皮下成瘤及原位膀胱腫瘤模型，通過在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ANLN基因與膀胱癌細(xì)胞增殖能力關(guān)系。
　　6.通過細(xì)胞劃痕及Tra

7、nswell小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)探索ANLN基因敲減對(duì)膀胱癌細(xì)胞J82及5637遷移、侵襲能力的影響。
　　7.通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)探索ANLN基因敲減對(duì)膀胱癌細(xì)胞J82及5637細(xì)胞周期及凋亡影響。
　　8.通過免疫熒光染色及細(xì)胞蘇木素伊紅染色探索ANLN基因敲減對(duì)J82細(xì)胞有絲分裂及細(xì)胞形態(tài)影響。
　　9.通過基因芯片分析J82細(xì)胞ANLN敲減組與對(duì)照組差異表達(dá)基因，探索ANLN基因參與膀胱癌發(fā)生及發(fā)展的機(jī)制及其與其他信

8、號(hào)通路、基因的相互作用。
　　[結(jié)果]
　　1.10例膀胱癌組織及其配對(duì)癌旁正常尿路上皮轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)大量差異表達(dá)信號(hào)分子，本研究采用以下條件對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選:①差異表達(dá)倍數(shù)log2-fold change≧2;②每對(duì)樣本測(cè)序RPKM值≧10;③候選基因在10對(duì)測(cè)序樣本中至少8對(duì)表達(dá)趨勢(shì)一致;④候選基因在膀胱癌組織與配對(duì)正常尿路上皮差異表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即probability≧0.8（相當(dāng)于p值＜0.01）;⑤候選

9、基因在已有膀胱癌研究文獻(xiàn)中無報(bào)道。通過上述條件篩選，ANLN基因符合以上所有要求，其log2-fold change倍數(shù)為2.926; ANLN差異表達(dá)probability為0.835; ANLN在每對(duì)樣本中測(cè)序RPKM值均≧10;測(cè)序10對(duì)樣本中，ANLN在9對(duì)膀胱癌組織中表達(dá)量顯著高于配對(duì)正常尿路上皮;尚無研究報(bào)道ANLN基因在膀胱癌中有相關(guān)作用。
　　2.選取40例患者膀胱癌組織及其配對(duì)正常尿路上皮組織行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)

10、檢測(cè)ANLN基因表達(dá)量，40例患者中36例膀胱癌組織ANLN表達(dá)量顯著高于配對(duì)正常尿路上皮。將40例驗(yàn)證標(biāo)本按照不同病理分期及分級(jí)分類，分別分析ANLN基因表達(dá)量。ANLN基因在肌層浸潤(rùn)性膀胱癌表達(dá)量明顯高于非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌，而ANLN基因表達(dá)量在高級(jí)別與低級(jí)別膀胱癌之間無明顯差異。
　　3.209例膀胱癌組織石蠟切片ANLN免疫組化染色分析發(fā)現(xiàn)肌層浸潤(rùn)性膀胱癌ANLN表達(dá)量顯著高于非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌(p＜0.01)，高級(jí)別膀胱

11、癌中ANLN表達(dá)量顯著高于低級(jí)別膀胱癌(p＜0.01)?；颊咂骄S訪27.9月，高表達(dá)ANLN膀胱癌患者腫瘤特異生存時(shí)間（中位生存時(shí)間為22.4月）明顯低于ANLN低表達(dá)患者（中位生存時(shí)間為37.3月，p=0.001）;ANLN高表達(dá)患者腫瘤無進(jìn)展生存時(shí)間（中位時(shí)間為19.7月）顯著低于ANLN低表達(dá)患者（中位時(shí)間為27.9月，p=0.001）;ANLN高表達(dá)患者腫瘤無復(fù)發(fā)生存時(shí)間（中位時(shí)間為17.1月）顯著低于ANLN低表達(dá)膀胱癌患者

12、(中位時(shí)間為25.2月，p=0.011)。
　　4.公共測(cè)序數(shù)據(jù)庫NCBI-GEO數(shù)據(jù)分析進(jìn)一步證實(shí)ANLN基因在肌層浸潤(rùn)性膀胱癌中表達(dá)量顯著高于非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌(p＜0.01)。TCGA數(shù)據(jù)庫分析則證實(shí)ANLN基因高表達(dá)患者腫瘤特異生存時(shí)間（中位生存時(shí)間14.75月）明顯低于ANLN基因低表達(dá)患者（中位生存時(shí)間36.86月，p=0.007）。
　　5.CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示，與陰性對(duì)照組相比，siRNA干擾ANLN基

13、因表達(dá)導(dǎo)致膀胱癌細(xì)胞J82與5637增殖能力顯著減弱。裸鼠皮下成瘤膀胱癌模型及原位膀胱腫瘤模型進(jìn)一步證實(shí)ANLN基因敲減導(dǎo)致膀胱癌細(xì)胞增殖能力減弱。
　　6.劃痕實(shí)驗(yàn)中，敲減ANLN基因后J82細(xì)胞與5637細(xì)胞的遷移能力較陰性對(duì)照組顯著下降。在Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，敲減ANLN基因可以顯著抑制J82和5637細(xì)胞的侵襲能力。
　　7.與陰性對(duì)照組相比，敲減ANLN基因?qū)е翵82及5637細(xì)胞出現(xiàn)G2期阻滯，而敲

14、減ANLN基因?qū)τ贘82與5637細(xì)胞凋亡則無明顯影響。Western-blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)ANLN基因敲減可導(dǎo)致J82與5637細(xì)胞中Cyclin B1與Cyclin D1蛋白表達(dá)降低。免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示ANLN蛋白參與有絲分裂過程中分裂溝形成。而細(xì)胞蘇木素伊紅染色則提示ANLN基因敲減導(dǎo)致膀胱癌細(xì)胞有絲分裂障礙，多核膀胱癌細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組顯著增加。
　　8.通過對(duì)ANLN基因敲減組與陰性對(duì)照組基因表達(dá)芯片分析，ANLN敲減引起的差異

15、表達(dá)基因GO分析結(jié)果顯示其功能主要與細(xì)胞移動(dòng)、遷移能力有關(guān)。而差異表達(dá)基因KEGG信號(hào)通路分析則提示ANLN基因參與膀胱癌發(fā)生及進(jìn)展的過程與Jak-STAT信號(hào)通路，Toll-like信號(hào)通路，PI3K/AKT信號(hào)通路，TNF信號(hào)通路有關(guān)。
　　[結(jié)論]
　　ANLN基因及其編碼的蛋白在膀胱癌組織中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與膀胱癌的病理分級(jí)與分期相關(guān)，ANLN高表達(dá)是膀胱癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。ANLN基因與膀胱癌進(jìn)展密切