人脂肪干細(xì)胞及生物可降解聚乳酸-膠原支架構(gòu)建組織工程輸尿管研究.pdf

1、研究背景及目的：輸尿管損傷后常常導(dǎo)致輸尿管缺損或狹窄，繼發(fā)患側(cè)尿路梗阻、感染、尿外滲、尿性囊腫等并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅患者的健康及生活質(zhì)量。對(duì)于損傷程度較重、缺損段較長的損傷，臨床上常以胃腸道替代輸尿管的方法處理。然而，腸代輸尿管后常伴隨各種并發(fā)癥的發(fā)生，如尿路結(jié)石，慢性感染，腸粘連等。有研究者嘗試使用人工合成材料或者異體移植的方法進(jìn)行處理，但是治療效果均不滿意。因此，輸尿管損傷后缺損的治療已經(jīng)成為泌尿外科的亟待解決的問題之一。組織工程科學(xué)的

2、發(fā)展為輸尿管損傷及缺損的修復(fù)重建提供了新的途徑。組織工程的方法進(jìn)行輸尿管重建必須解決兩個(gè)關(guān)鍵問題：支架材料及種子細(xì)胞。本研究以人脂肪干細(xì)胞為種子細(xì)胞，以聚乳酸／膠原為基本材料制作一種新型輸尿管支架材料，擬為輸尿管組織工程重建提供一種新的可行的治療方法。
　　研究的主要目的為：
　　l、探索人脂肪干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定的方法，為以脂肪干細(xì)胞為種子細(xì)胞的研究提供實(shí)踐基礎(chǔ)：
　　2、探索人脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為尿路上皮的可行

3、性；為輸尿管組織工程研究提供新的種子細(xì)胞來源：
　　3、制作一種新型組織工程輸尿管支架，并評(píng)估這種新型輸尿管支架是否利于人脂肪干細(xì)胞的生長、增殖：
　　4、將攜帶細(xì)胞的新型輸尿管支架置入裸鼠體內(nèi)，評(píng)價(jià)材料的生物相容性，觀察支架材料內(nèi)細(xì)胞存活狀態(tài)、誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞表型能否保持，以初步評(píng)估利用這種新型輸尿管支架材料進(jìn)行組織工程輸尿管的可行性。
　　方法：
　　1．取吸脂術(shù)患者皮下脂肪組織，采用酶消化法分離人脂肪干細(xì)胞

4、，通過流式細(xì)胞學(xué)的方法鑒定其表型特征，通過成脂、成骨誘導(dǎo)初步鑒定其分化潛能。
　　2．通過Transwell間接共培養(yǎng)法進(jìn)行脂肪干細(xì)胞向尿路上皮細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，采用RT-PCR、westernblot、免疫熒光的方法對(duì)誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行尿路上皮標(biāo)志物的(CK-18，UP2)表達(dá)鑒定。
　　3．以聚乳酸及I型膠原作為基本原料，采用溶劑揮發(fā)法及電紡絲方法制作一種新型生物可降解輸尿管支架材料，將脂肪干細(xì)胞與支架材料進(jìn)行體外復(fù)合培養(yǎng)，

5、通過電鏡、LIVE/DEAD、H&E染色、MTT等方法評(píng)估新型輸尿管支架是否利于人脂肪干細(xì)胞的生長、增殖。
　　4．將攜帶人脂肪干細(xì)胞的新型輸尿管支架材料植入裸小鼠（4周齡雌性）背部皮下，生長14天后取材，進(jìn)行細(xì)胞徑際分析、H&E染色、尿路上皮標(biāo)志物的免疫熒光鑒定。
　　結(jié)果：
　　1．采用酶消化法分離的脂肪干細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)呈貼壁生長，倒置光學(xué)顯微鏡下觀察呈長梭形，流式細(xì)胞學(xué)檢測表明，細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)志物（

6、CD29，CD44，CD90以及CD105），不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD31及組織相容性抗原標(biāo)志HLA-DR。成脂誘導(dǎo)14天后細(xì)胞內(nèi)可見大量脂滴，并且油紅O染色呈陽性；成骨誘導(dǎo)21天后，茜素紅染色后觀察可見鈣結(jié)節(jié)形成。
　　2．通過與尿路上皮的間接共培養(yǎng)7天后，誘導(dǎo)后的細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)尿路上皮細(xì)胞樣，培養(yǎng)14天后，RT-PCR及westernblot可檢測到尿路上皮標(biāo)志物(CK-18、UP2)在基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平上調(diào)。免疫熒光檢測

7、表明，40％—50%的誘導(dǎo)后的干細(xì)胞表達(dá)尿路上皮標(biāo)志物（CK-18及UP2）。
　　3．電鏡觀察聚乳酸／I型膠原輸尿管支架材料的表面具有三維空間結(jié)構(gòu)，材料由直徑約3微米(3.44±0.94μm)的纖維構(gòu)成，纖維間形成孔徑約10微米(10.54±3.18μm)的孔隙。細(xì)胞支架體外孵育培養(yǎng)后3天，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)支架材料表面細(xì)胞呈鋪展?fàn)顟B(tài)，均勻分布于支架表面；MTT實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞種植在支架后第l，3，5，7天進(jìn)行連續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)攜帶膠原的支架材料

8、細(xì)胞呈現(xiàn)持續(xù)增殖的趨勢；細(xì)胞種植7天后H&E染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞均勻分布于支架材料表面，部分細(xì)胞浸潤生長進(jìn)入材料的內(nèi)部；Live/dead檢測發(fā)現(xiàn)材料上生長的細(xì)胞90%以上為活細(xì)胞。
　　4．所有16只動(dòng)物在攜帶細(xì)胞的新型輸尿管支架材料植入體內(nèi)14天的實(shí)驗(yàn)期間均安全存活，傷口愈合良好，無感染、炎癥反應(yīng)發(fā)生，誘導(dǎo)后的人脂肪干細(xì)胞能夠在裸鼠體內(nèi)存活達(dá)14天，浸潤入支架材料的內(nèi)部，并能夠表達(dá)尿路上皮的標(biāo)志物。
　　結(jié)論：
　　1、采

9、用酶消化法提取人脂肪干細(xì)胞是可行的，提取的細(xì)胞能夠表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，具有良好的增殖及分化潛能。
　　2、采用間接共培養(yǎng)法能夠誘導(dǎo)人脂肪干細(xì)胞向尿路上皮細(xì)胞分化，誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，并且可表達(dá)尿路上皮的標(biāo)志物。
　　3、采用聚乳酸／I型膠原材料制作的新型輸尿管支架材料，能夠適合人脂肪干細(xì)胞的生長增殖。
　　4、體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)證實(shí)攜帶細(xì)胞的新型輸尿管支架材料具有良好的生物學(xué)性能，誘導(dǎo)分化后的人脂肪干細(xì)胞在隨支