豬偽狂犬病病毒gI-gE基因缺失變異株的構(gòu)建和免疫性評(píng)價(jià).pdf

1、偽狂犬病（Pseudorabies，PR）是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的家畜和野生動(dòng)物發(fā)病的一種急性傳染病，豬是其主要的宿主，因此對(duì)豬的危害最大。豬偽狂犬病病毒是當(dāng)前對(duì)我國(guó)豬場(chǎng)造成重大損失的主要病毒之一。目前，國(guó)內(nèi)尚無(wú)治療PR的有效藥物。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)分離獲得PRV-GD2013豬偽狂犬變異毒株，利用同源重組技術(shù)構(gòu)建不含標(biāo)記基因（EGFP）的gI/gE雙基因缺失毒株。對(duì)重組偽狂犬病病毒免疫性評(píng)價(jià)進(jìn)行

2、初步研究，為研發(fā)偽狂犬疫苗提供材料。研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：
　　（1）本研究于2013年3月在廣東某豬場(chǎng)采集疑似偽狂犬病的豬腦組織。對(duì)腦組織進(jìn)行病毒分離，通過(guò)透射電鏡觀察及PCR擴(kuò)增gB和gE序列，并進(jìn)行序列測(cè)定。結(jié)果表明，透射電鏡顯示該病毒粒子具有典型的皰疹病毒結(jié)構(gòu)，PCR可以擴(kuò)增出偽狂犬病病毒gB和gE基因，經(jīng)序列分析和生物學(xué)特性鑒定，證實(shí)該分離毒株為我國(guó)近幾年流行的PRV變異株，并將其命名為PRV-GD2013株。
　　

3、（2）偽狂犬病病毒gI/gE雙基因缺失載體的構(gòu)建：以GD2013株偽狂犬病病毒的DNA為模板，PCR分別擴(kuò)增出gI、gE兩條片段，用作轉(zhuǎn)移載體的上下臂，同時(shí)從pEGFP-C3質(zhì)粒中擴(kuò)增出CMV-EGFP-SV40 polyA信號(hào)序列片段。然后，通過(guò)Over-lap方法分別擴(kuò)出gI-EGFP-gE和gI-gE兩條片段，并通過(guò)同源重組方法將這兩條片段分別組裝于pBluescript KS（+）載體中。從而獲得pBLE-gI-EGFP-gE轉(zhuǎn)

4、移載體和pBLE-gI-gE轉(zhuǎn)移載體。將PRV-GD2013、pBLE-gI-EGFP-gE轉(zhuǎn)移載體和Lipofectamin?2000轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，待出現(xiàn)80％細(xì)胞病變時(shí)收獲病毒。通過(guò)空斑純化法篩選得到重組病毒PRV-GD2013-△gI/gE-EGFP。然后將PRV-GD2013-△gI/gE-EGFP病毒、pBLE-gI-gE轉(zhuǎn)移載體和Lipofectamin?2000轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，空斑純化法篩

5、選得到重組病毒PRV-GD2013-△gI/gE。通過(guò)PCR序列分析結(jié)果表明，PRV-GD2013-△gI/gE在gI和gE基因內(nèi)部缺失2169bp。
　?。?）缺失毒株生長(zhǎng)特性及免疫效力的研究：對(duì)gI和gE雙基因缺失毒株的生長(zhǎng)特性及免疫效力的研究發(fā)現(xiàn)，PRV-GD2013-△gI/gE和PRV-GD2013在BHK-21細(xì)胞上的最高滴度為108.00TCID50，沒(méi)有差異。將不同劑量的PRV-GD2013-△gI/gE接種仔豬（