缺氧對心房鈉尿肽分泌的影響及心肌保護作用研究.pdf

1、心臟是推動血液流動的動力器官，直到1981年De Bold等發(fā)現(xiàn)心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide,ANP）之后，確定心臟不僅是個血泵，同時也是內(nèi)分泌器官，可以生成和分泌ANP。ANP是鈉尿肽家族（family of natriuretic peptides,NPs）的第一個成員，之后相繼發(fā)現(xiàn)了NPs的其他成員，即腦鈉肽（brain natriuretic peptide,BNP）、C-型鈉尿肽（c-typ

2、e natriuretic peptide,CNP）和 D-型鈉尿肽（dendroaspis natriuretic peptide,DNP）。ANP是由心房肌細胞合成和釋放，并與心臟、血管、消化道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、淋巴組織、生殖器官及腎臟組織等存在的鈉尿肽受體（natriuretic peptide receptors,NPRs）結(jié)合，從而發(fā)揮一系列生物學(xué)效應(yīng)。ANP的主要生物學(xué)作用是排鈉利尿，參與水鹽平衡和血壓調(diào)節(jié)等，對維持人體內(nèi)環(huán)境

3、穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用。而近年來，越來越多的研究逐漸揭示了 ANP的其他生物學(xué)功能，例如抵制心肌肥厚和抗纖維化；改善心肌結(jié)構(gòu)、抵抗心力衰竭；抵制氧化應(yīng)激反應(yīng)和減少自由基生成等，對于ANP的心肌保護作用有了新的認識。ANP的分泌受物理因素、體液因素和神經(jīng)因素等影響。如增加血容量、心房膨脹或心房壓力升高、缺血缺氧以及內(nèi)皮素、血管緊張素Ⅱ、糖皮質(zhì)激素等均能影響ANP的釋放。此外，腎上腺素能、膽堿能以及肽能受體對ANP分泌也有調(diào)節(jié)作用。然而心房肌細胞

4、的牽張（stretch）刺激被認為是調(diào)節(jié) ANP分泌的最關(guān)鍵因素。
　　缺氧缺血是調(diào)節(jié)ANP分泌的另外一種重要因素。離體情況下，在體外培養(yǎng)的心房肌細胞和離體心臟灌流模型中的實驗均證實缺氧能明顯促進ANP分泌，同時在整體實驗中，例如肺動脈高壓癥、心力衰竭及高海拔環(huán)境等同樣能使外周血液中的ANP濃度明顯增高。Skvorak等報道，缺血誘導(dǎo)ANP分泌增加歸根于內(nèi)皮素（endothelin,ET）的增加，且缺血缺氧時分泌增加的ANP被視為

5、是調(diào)節(jié)機體穩(wěn)態(tài)的反應(yīng)機制，但目前缺氧調(diào)節(jié)ANP分泌的機制尚未弄清。
　　缺氧是一種組織得不到充足的氧或不能充分利用氧時，組織的代謝、功能等發(fā)生異常變化的病理過程，是許多疾病狀態(tài)如心肌梗死、腦卒中等的病理生理學(xué)改變的主要原因。缺氧時引發(fā)一系列信號傳遞過程，其中包括缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1,HIF-1）的激活。HIF-1是在缺氧誘導(dǎo)的肝癌細胞細胞核抽提物中發(fā)現(xiàn)的廣泛存在于哺乳動物體內(nèi)的DN

6、A結(jié)合蛋白，是目前唯一一個具有高度特異性、在缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性及專一調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵性核轉(zhuǎn)錄因子，其生物學(xué)效應(yīng)由亞基HIF-1實現(xiàn)。HIF-1α是一個重要的中介物質(zhì)，通過它進而對一系列的低氧反應(yīng)基因（hypoxia responsive genes,HRG）進行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，從而產(chǎn)生一系列對缺氧的適應(yīng)性反應(yīng)。其中HIF-1直接與心肌細胞中內(nèi)皮素-1（ET-1）基因啟動子結(jié)合位點結(jié)合來實現(xiàn)對ET-1表達的調(diào)控。研究證實，慢性反復(fù)缺氧后HIF-

7、1α與促進ET-1基因表達有關(guān)，且ET系統(tǒng)的活性受HIF-l活性的調(diào)節(jié)。ET是血管內(nèi)皮細胞合成和分泌的具有收縮血管功能的活性多肽，其中ET-1是ET家族中含量最多、生物活性最強的一員，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強有力的縮血管因子。而ET-1也是強烈促進ANP分泌的重要因素，故推測HIF-1或者其靶基因ET-1可能參與調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)ANP的分泌。
　　缺氧時HIF-1的表達與活性的調(diào)節(jié)主要受細胞氧濃度的影響，這是它的一個特征。但是其他信號通路

8、也參與調(diào)節(jié)HIF-1α表達，其中重要的一條通路是就是促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated-protein-kinase,MAPK）途徑。MAPK可促進HIF-1α磷酸化，參與HIF-1α的表達量和活性的調(diào)節(jié)。MAPK通路包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）、c-Jun N-末端激酶（c-Jun N-teminal kinase,JNK）也稱之為應(yīng)

9、激活化蛋白激酶1（stress activated protein kinase,SAPK1）及P38蛋白激酶（P38 MAP kinase）。最近研究發(fā)現(xiàn)，心肌中的ANP是由HIF-1誘導(dǎo)生成的。HIF-l的大量表達可明顯增強ANP啟動子的活性。其他研究也發(fā)現(xiàn)，缺血缺氧時HIF-1可能通過激活心肌ANP表達而發(fā)揮對心肌的保護作用。但目前缺氧時HIF-1與ANP的分泌或調(diào)節(jié)HIF-1活性的MAPK信號通路與ANP分泌的相互關(guān)系尚不完全明

10、確。
　　因此，本實驗利用家兔離體心房灌流裝置和以氮氣制備急性缺氧模型，采用內(nèi)皮素A型受體（ET A receptor,ETA）阻斷劑和內(nèi)皮素B型受體（ET B receptor，ETB）阻斷劑BQ123和BQ788以及JNK抑制劑SP600125等，觀察急性缺氧對家兔離體心房ANP分泌的影響，探討缺氧時ANP分泌變化與內(nèi)源性ET-1的相互關(guān)系，揭示MAPK的JNK信號通路對缺氧誘導(dǎo)ANP分泌中的重要作用，為研究缺氧時ANP分泌機

11、制及其功能提供必要的實驗依據(jù)。
　　本實驗結(jié)果如下：
　　1.在家兔離體心房灌流模型中，急性缺氧明顯促進心房ANP的分泌（P<0.001 vs control），同時強烈抑制心房搏動壓（P<0.001 vs control）和心房搏出量（P<0.001 vs control）。
　　2.缺氧能增加離體心房ET-1的釋放（P<0.05 vs control）；同時預(yù)處理兩種ET-1受體阻斷劑（BQ123+BQ788）后再

12、制備缺氧時發(fā)現(xiàn)，BQ123+BQ788明顯抑制缺氧誘導(dǎo)心房ANP的分泌（P<0.001 vs hypoxia），但并不能完全阻斷其效應(yīng)，此時心房搏動壓和心房搏出量均顯著下降（P<0.001 vs control）。
　　3. MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的JNK途徑抑制劑SP600125可明顯減緩缺氧促進ANP分泌的效應(yīng)（P<0.001 vs hypoxia）和缺氧對ET-1的分泌（P<0.05 vs hypoxia）；SP600125對

13、缺氧誘導(dǎo)ANP分泌作用明顯強于BQ123+BQ788的作用（P<0.001 vs BQ123+BQ788），但依然沒有全部阻斷缺氧對ANP分泌的增加，此時心房搏動壓和心房搏出量也均顯著下降（P<0.001 vs control）。
　　4. SP600125+BQ123+BQ788一同處理依然明顯抑制缺氧誘導(dǎo) ANP的分泌（P<0.001 vs hypoxia），且其作用與單獨處理SP600125時的效應(yīng)無顯著差異，但仍強于BQ1

14、23+BQ788對缺氧誘導(dǎo)ANP分泌的抑制作用（P<0.001 vs BQ123+BQ788）。
　　以上結(jié)果提示：
　　1.急性缺氧明顯增加離體心房ANP的分泌；
　　2.HIF-1的靶基因ET-1參與調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)ANP分泌的過程；
　　3.調(diào)節(jié)HIF-1活性的JNK信號途徑在缺氧誘導(dǎo)ANP分泌過程中起重要作用。
　　心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）是1981年D

15、e Bold等發(fā)現(xiàn)的由心房肌細胞合成和分泌的肽類激素。最早發(fā)現(xiàn)的ANP生物學(xué)作用是排鈉利尿，參與水鹽平衡和血壓調(diào)節(jié)等。但是隨著對ANP的深入研究發(fā)現(xiàn)，ANP與許多缺血缺氧相關(guān)性疾病如急性心肌梗死（acute myocardial infarction,AMI）、充血性心力衰竭（congestive cardiac failure,CHF）、肺動脈高血壓引起的肺心病（pulmonary heart disease,PHD）、慢性阻塞性肺疾

16、?。╟hronic obstructive pulmonary disease,COPD）等關(guān)系密切。后經(jīng)證實，ANP在此類疾病發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮抵制心肌肥厚和抗纖維化；抵抗心力衰竭、改善心肌結(jié)構(gòu)；抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少自由基生成以及抵制心肌缺血/再灌注損傷等重要的生物學(xué)效應(yīng)。
　　心肌缺血/再灌注損傷（myocardial ischemia/reperfusion injury,MIRI）是指缺血的心肌經(jīng)恢復(fù)血液灌注后不但不能

17、使其功能和結(jié)構(gòu)得到恢復(fù)，反而加重其功能障礙和結(jié)構(gòu)的損傷。由于在缺血性心臟病治療（再灌注）過程中易發(fā)生MIRI，使得缺血性心臟?。╥schemic heart disease,IHD）的治療難度加大，且目前對其還沒有有效的防治手段。近年來，很多研究證實，ANP對缺血/再灌注損傷具有較好的保護作用。ANP不僅可以增加動物模型中再灌注心臟的心輸出量、減少缺血/再灌注心臟的心梗面積，在急性心肌梗死患者體內(nèi)注射ANP能抵制缺血/再灌注帶來的心臟損

18、傷，但是ANP發(fā)揮心肌保護的具體作用機制還不清楚。
　　研究認為，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore,mPTP）的開放是導(dǎo)致缺血/再灌注損傷的關(guān)鍵性因素。Halestrap等報道，mPTP的開放發(fā)生在再灌注期，而不是缺血期，并且防止mPTP的開放是減輕再灌注損傷的有效手段，抑制mPTP的開放是許多心臟保護類物質(zhì)抗缺血/再灌注損傷的共同機制。正常狀態(tài)下，mPTP

19、保持關(guān)閉狀態(tài)抵制氫離子等進入線粒體內(nèi)，使線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential,ΔΨm）維持內(nèi)負外正。當mPTP開放時，立即引起ΔΨm的去極化，使ΔΨm衰減。
　　糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase3β,GSK-3β）在心肌保護中也起非常重要的作用。靜息時GSK-3β保持激活狀態(tài)，而用藥物抑制GSK-3β的活性能減輕心肌缺血/再灌注損傷。已證實的GSK-3β

20、心肌保護作用機制主要是通過GSK-3βSer9位點的磷酸化抑制其活性，從而阻止mPTP的開放來保護再灌注損傷的心肌。
　　ANP可以催化顆粒狀鳥苷酸環(huán)化酶（particulate guanylyl cyclase,pGC），從而使細胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate,cGMP）生成增多。相關(guān)研究證實，ANP對心肌缺血/再灌注損傷的保護作用與ANP誘導(dǎo)cGMP的生成有關(guān)。蛋白激酶G（prot

21、ein kinase G,PKG）是cGMP的重要下游信號，而cGMP/PKG信號途徑通過防止mPTP的開放來實現(xiàn)對缺血/再灌注心臟的保護作用。非特異性磷酸二酯酶抑制劑異丁基甲基黃嘌呤（3-Isobutyl-1-methylxanthine,IBMX）通過cGMP/PKG途徑使GSK-3β失活，從而抑制mPTP的開放。因此本研究推測，ANP的心肌保護作用可能通過cGMP/PKG信號途徑而抑制GSK-3β的活性，進而防止mPTP的開放來實

22、現(xiàn)。
　　除此之外，GSK-3β活性受磷脂酰肌醇三羥基激酶（Phosphoinositide3-kinase,PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號途徑的調(diào)節(jié)。PI3K/Akt信號通路在缺血預(yù)處理引起的心臟保護中發(fā)揮重要作用，并且該信號通路通過抑制mPTP的開放來抵制缺血/再灌注損傷。最近報道，ANP能通過激活A(yù)kt來抑制細胞編程性死亡（apoptosis）。
　　因此，本實驗利用langendorff裝置和H9c2大鼠心肌細

23、胞株，觀察ANP對大鼠缺血/再灌注損傷的保護作用，并探討ANP的心臟保護作用與mPTP開放及GSK-3β之間的相互關(guān)系，進一步觀察PKG/cGMP和PI3K/Akt信號途徑在ANP誘導(dǎo)心肌保護中的作用。
　　本實驗結(jié)果如下：
　　1.固定于Langendorff裝置的心臟經(jīng)過30min缺血期和120min的再灌注期，再灌注開始前5min給與ANP并持續(xù)35min。結(jié)果顯示，與對照組相比ANP（0.03μmol/L）使大鼠心臟

24、心肌梗死面積明顯減?。≒<0.001 vs control），表明ANP能夠保護再灌注心臟。對照組和實驗組缺血之前左心室發(fā)展壓（left ventricular-developed pressure，LVDP）和左室舒張末期壓力（end-diastolic pressure,EDP）無明顯差異（P>0.05）。
　　2.采用四甲基羅丹明乙酯（tetramethyrhodamine ester,TMRE）熒光染料和激光共聚焦顯微鏡成

25、像技術(shù)，測定線粒體ΔΨm的變化，以判斷mPTP的開放程度。對照組用600μM H2O2處理20min后，TMRE熒光強度明顯減小，說明氧化應(yīng)激引起mPTP的開放。與此相比，0.01、0.1、1.0、10.0nmol/L的ANP明顯抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的TMRE熒光強度的減少（P<0.01 vs control），其中1.0nmol/L ANP的效應(yīng)為最強，提示ANP能夠抑制mPTP的開放。
　　3.利用Western blotting

26、觀察GSK-3βSer9位點磷酸化的情況，以探討GSK-3β在ANP抑制mPTP開放中的作用。用ANP處理H9c2細胞20min，0.01、0.1、1.0、10.0、100.0nmol/L的ANP明顯增加GSK-3β的磷酸化（P<0.01 vs control），表明ANP能夠抑制GSK-3β的活性。用激活型GSK-3β質(zhì)粒（GSK-3β-S9A）轉(zhuǎn)染細胞，使GSK-3β處于持續(xù)激活狀態(tài)后發(fā)現(xiàn)，ANP（1.0nmol/L）未能防止TMR

27、E熒光強度的減少（P<0.05 vs ANP）。由于抑制GSK-3β的活性可阻止mPTP的開放，此結(jié)果進一步證明了ANP通過抑制GSK-3β活性而阻止mPTP的開放。
　　4.為了探討ANP是否通過PKG使GSK-3β失活，進而抑制mPTP的開放，用PKG阻斷劑KT5823（1.0μmol/L）處理細胞后觀察了ANP（0.1和1.0nmol/L）對mPTP開放和GSK-3β活性的影響。結(jié)果顯示，KT5823明顯衰減ANP抑制mPT

28、P開放和GSK-3β磷酸化的作用（P<0.01 vs ANP）。進一步的實驗顯示，cGMP類似物8-Br-cGMP本身并不能明顯增強GSK-3β磷酸化，而必須和PKG Iα共同作用時才表現(xiàn)出增加GSK-3β磷酸化的作用。同樣，8-Br-cGMP與PKG Iα的直接相互作用使純化GSK-3β的磷酸化明顯增加。以上結(jié)果表明，ANP通過cGMP/PKG使GSK-3β失活，進而防止mPTP的開放。
　　5.用PI3K/Akt特異性抑制劑L

29、Y294002，探討了PI3K/Akt是否介導(dǎo)ANP對心肌的保護作用。LY294002（1.0μmol/l）能明顯減弱ANP（0.1、1.0nmol/L）對mPTP開放和GSK-3β的抑制作用（P<0.01 vs ANP），提示PI3K/Akt參與ANP對GSK-3β和mPTP的抑制作用。
　　結(jié)論：
　　1.ANP顯著減少缺血/再灌注心臟的心肌梗死面積；
　　2.ANP通過PKG和PI3K/Akt途徑使GSK-3β失