蛋白結(jié)構(gòu)完整性和松材線蟲伴生細(xì)菌對Bt殺線蟲活性影響研究.pdf

1、松材線蟲?。˙ursaphelenchus xylophilus）是一世界性的檢疫性病害，已經(jīng)對我國造成了巨大的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)損失，嚴(yán)重影響森林健康和生態(tài)安全。cry5Ba3Φ是本實(shí)驗(yàn)室從蘇云金芽孢桿菌zjfc85上克隆得到的毒蛋白基因經(jīng)密碼子改造而來，其編碼的毒蛋白對松材線蟲毒殺活性已被證實(shí)。為進(jìn)一步明確該殺蟲蛋白結(jié)構(gòu)與毒力功能的關(guān)系，本研究設(shè)計(jì)Cry5Ba3Φ蛋白結(jié)構(gòu)突變?nèi)毕菪娃D(zhuǎn)灰葡萄孢菌株，并測試其毒殺活性變化。為探索長期接觸Cry5

2、Ba3Φ蛋白是否會使松材線蟲產(chǎn)生毒力適應(yīng)性表型及與線蟲伴生細(xì)菌菌群間潛在的關(guān)聯(lián)，本研究觀察隨毒蛋白接觸時(shí)間和接觸頻次松材線蟲的種群密度變化情況，并分析適應(yīng)Cry5Ba3Φ蛋白前后松材線蟲體內(nèi)和體外的伴生細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)。主要結(jié)果如下:
　　1.利用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行Cry5Ba3Φ毒蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析，在保留其毒性中心區(qū)的基礎(chǔ)上破壞其完整性結(jié)構(gòu)，選擇了五處氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行截短，得到六條不同長度的cry5Ba3Φ基因片段。利用Gibson

3、技術(shù)將這些基因片段裝載到pTFCM載體上，再通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，將cry5Ba3Φ缺失片段整合至灰葡萄孢菌的基因組中。生測實(shí)驗(yàn)表明，破壞Cry5Ba3Φ蛋白的不同區(qū)域結(jié)構(gòu)會對其作用松材線蟲的毒力造成不同程度影響。
　　2.相比于野生型灰葡萄孢菌，用轉(zhuǎn)cryBa3Φ基因灰葡萄孢菌飼喂的松材線蟲其種群繁殖受到明顯抑制，但是隨著接觸時(shí)間延長或者接觸頻次增加，松材線蟲種群密度開始回升且與相應(yīng)野生型灰葡萄孢菌上線蟲的種群密度無明顯差異

4、。運(yùn)用變性梯度凝膠電泳方法(DGGE)檢測野生型和轉(zhuǎn)cry5Ba3Φ基因灰葡萄孢菌上連續(xù)轉(zhuǎn)板培養(yǎng)線蟲的伴生細(xì)菌菌群群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)松材線蟲體內(nèi)和體外的伴生細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)變化與線蟲對Cry5Ba3Φ的適應(yīng)能力間呈現(xiàn)出一定的關(guān)聯(lián)性。
　　本研究初步探索了Cry5Ba3Φ結(jié)構(gòu)完整性對毒力的影響以及松材線蟲伴生細(xì)菌菌群變化與線蟲適應(yīng)Cry5Ba3Φ毒殺活性之間的潛在關(guān)聯(lián)，為下一步明確線蟲伴生細(xì)菌在毒蛋白適應(yīng)能力形成過程中的調(diào)控功能以及伴生細(xì)菌