耐頭孢曲松淋球菌的體外人工誘導(dǎo)及其耐藥機制的研究.pdf

1、背景與目的：淋病是世界各國(包括我國)最常見的性傳播感染性疾病(sexuallytransmittedinfections，STIs)之一，其致病菌為淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoeae，簡稱淋球菌)。淋球菌的重要特點之一是容易對多種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性，從而造成治療上的困難。全球的STIs流行病學(xué)研究結(jié)果表明，淋病發(fā)病率從上個世紀(jì)八十年代到九十年代早期有所下降，但自九十年代后期開始其發(fā)病率又有上升趨勢。造成淋病發(fā)病率再

2、次上升的一個重要原因是淋球菌對多種抗菌藥物耐藥性的增加，其中多重耐藥的情況較為突出，并且近年來國內(nèi)外還發(fā)現(xiàn)淋球菌對頭孢曲松敏感性降低的情況。由于目前美國疾病預(yù)防與控制中心(CDC)、世界衛(wèi)生組織(WHO)及我國衛(wèi)生部推薦的治療淋病的一線藥物是第三代頭孢類抗生素頭孢曲松(Ceftriaxone，CRO)，耐頭孢曲松淋球菌的出現(xiàn)及流行將使淋病的治療面臨更嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)：一旦淋球菌對第三代頭孢類抗生素產(chǎn)生耐藥，目前淋病治療的最后一道防線將被突破，

3、發(fā)病率將急劇增加，治療將十分困難，淋病的流行將更加廣泛。因此，研究淋球菌對頭孢曲松的耐藥機制刻不容緩。由于迄今為止國外尚未分離出耐CRO的淋球菌，故對其耐藥機制的研究開展得不多，因此，我們擬采用人工誘導(dǎo)的方法在實驗室誘導(dǎo)出耐CRO的淋球菌，用抑制性削減雜交技術(shù)(suppressionSubtractivehybridization，SSH)尋找淋球菌對CRO耐藥的相關(guān)基因，前瞻性地研究淋球菌耐第三代頭孢類抗生素的機制，為制定出防止或延緩

4、耐CRO淋球菌產(chǎn)生的措施提供理論依據(jù)。本研究的結(jié)果對我國乃至全球淋病的預(yù)防和治療將有十分重大的意義。 方法：1.用次抑菌濃度生長誘導(dǎo)法將對CR0敏感的淋球菌臨床分離株(編號2003-5-12，簡稱臨床株)和國際標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC49226)誘導(dǎo)成耐CRO菌株。并用紙片法測定誘導(dǎo)前后淋球菌對青霉素、四環(huán)素、紅霉素及環(huán)丙沙星敏感性，觀察耐CRO誘導(dǎo)前后淋球菌對其它抗菌藥物的敏感性的變化。 2.采用透射電鏡觀察誘導(dǎo)前后淋球菌菌體

5、結(jié)構(gòu)的變化。 3.用SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳對CRO耐藥誘導(dǎo)前后淋球菌的膜蛋白進行電泳分析，了解誘導(dǎo)前后淋球菌膜蛋白的變化，進而推測膜蛋白的改變在淋球菌耐CRO中的作用。 4.用抑制性消減雜交技術(shù)(SSH)篩選誘導(dǎo)前后淋球菌表達的差異基因，測序后送基因庫做BLAST對比分析，從而在基因水平闡明淋球菌耐CRO的機制。 結(jié)果：1.用次抑菌濃度法成功誘導(dǎo)出耐CRO淋球菌，誘導(dǎo)后淋球菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC49226)和臨床

6、株對CRO的MIC值分別達到0.032μg/ml和2.0μg/ml；耐藥穩(wěn)定性試驗表明所誘導(dǎo)的菌株的耐藥性高度穩(wěn)定。 2.淋球菌對CRO產(chǎn)生誘導(dǎo)耐藥的同時，對青霉素、四環(huán)素、紅霉素及環(huán)丙沙星也產(chǎn)生耐藥或耐藥性增加，出現(xiàn)多重耐藥。 3.透射電鏡顯示淋球菌耐CRO株的膜致密染色帶比敏感株厚，提示膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化；細(xì)胞分裂相增多，提示耐CRO株的生長周期發(fā)生了改變，這些改變可能使得淋球菌更好的適應(yīng)生長環(huán)境。 4.膜蛋

7、白的SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳結(jié)果顯示，耐CRO淋球菌的膜孔蛋白(33kDa)的表達減少，而Mtr泵蛋白(44kDa)的表達增加，提示淋球菌對CRO的耐藥機制與孔蛋白及Mtr泵蛋白的改變有關(guān)。 5.抑制性消減雜交結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC49226)耐CRO誘導(dǎo)前后的差異表達基因有17個，臨床株有22個；基因庫的BLAST比對分析表明，淋球菌中與耐CRO密切相關(guān)的基因有mtrR、mtrC、PDJ1質(zhì)粒、rpsJ基因；隨著淋球菌產(chǎn)

8、生對CRO的耐藥性，與淋球菌復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、代謝及致病性等相關(guān)基因也發(fā)生了相應(yīng)的改變。 結(jié)論：1.用次抑菌濃度的CRO瓊脂培養(yǎng)基能將對CRO敏感的淋球菌國際標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC49226)和臨床株誘導(dǎo)成對CRO穩(wěn)定耐藥的菌株。 2.淋球菌對CRO產(chǎn)生誘導(dǎo)耐藥的同時，對青霉素、四環(huán)素、紅霉素及環(huán)丙沙星也產(chǎn)生耐藥或耐藥性增加，出現(xiàn)多重耐藥，機制不明。 3.膜蛋白電泳分析及SSH的結(jié)果提示外膜孔蛋白和Mtr泵蛋白的改變及