大鼠膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子克隆及表達(dá)的研究.pdf

1、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cellline-derived neurotrophic factor GDNF)是1993年被發(fā)現(xiàn)的對多巴胺能神經(jīng)元有特異性營養(yǎng)作用的一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，結(jié)構(gòu)顯示它是TGF-β超家族中的一個(gè)新的成員。自GDNF被發(fā)現(xiàn)以后，眾多學(xué)者對其結(jié)構(gòu)、分布、功能與作用進(jìn)行了大量的研究，并取得了相當(dāng)有意義的成果，同時(shí)GDNF在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面被廣泛研究，包括對帕金森氏病(PD)、脊髓側(cè)索硬化癥(ALS)及其

2、他神經(jīng)變性疾病等領(lǐng)域的研究，其中PD的病理基礎(chǔ)已經(jīng)明確，是由于選擇性多巴胺能神經(jīng)元喪失導(dǎo)致多巴胺缺乏所致，目前認(rèn)為，基因治療可能是實(shí)現(xiàn)治療PD這一目標(biāo)的最佳途徑，而對PD等疾病的治療手段包括藥物治療和各種外科手術(shù)、腦組織移植等均只限于暫時(shí)的癥狀改善，不能從根本上延緩或阻止其病程進(jìn)展，理想的治療方法除了要糾正其腦內(nèi)DA含量的不足，還要保護(hù)殘存的DA能神經(jīng)元。迄今為止，國內(nèi)外的基因治療研究探索主要集中于兩個(gè)方向，一是通過給予各種神經(jīng)營養(yǎng)因子

3、或抗凋亡分子基因，研究其對DA能神經(jīng)元的保護(hù)作用；二是通過給予酪氨酸羥化酶(TH)基因，提高DA的合成。國內(nèi)外研究表明了GDNF是最強(qiáng)有力的保護(hù)因子，GDNF基因的有效表達(dá)可以減緩、阻止甚至逆轉(zhuǎn)DA能神經(jīng)元的退行性病變過程，為此我們克隆了大鼠GDNF全長基因，主要采用分子克隆、細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物肌肉表達(dá)等研究方法，將GDNF基因分別構(gòu)建入原核表達(dá)載體pET32a和真核表達(dá)載體pEGFP-Cl，通過IPTG誘導(dǎo)法和離體細(xì)胞轉(zhuǎn)染法研究證實(shí)其具有

4、明確的轉(zhuǎn)基因生物活性后，再將真核重組表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-GDNF注射到小鼠后肢股四頭肌內(nèi)，初步了解其體內(nèi)表達(dá)情況，以此尋找基因治療的最佳途徑。 主要研究方法和結(jié)果如下： 1．從2日內(nèi)大乳鼠腦組織中提取總RNA，參照分子克隆指南稍作修改，合成cDNA第1、2鏈，加入引物通過PCR擴(kuò)增目的基因，得到636bp的目的片段后，克隆到pMD18-T載體中，得到重組pMD18-T-GDNF。 2．將GDNF克隆到pGEM-T

5、載體中，得到重組pGEM-T-GDNF；將重組質(zhì)粒pGEM-T-GDNF、pET32a原核表達(dá)載體及pEGFP-C1真核表達(dá)載體進(jìn)行BamHI、XhoI雙酶切，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，然后對重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定、PCR鑒定并測序驗(yàn)證。 3．將鑒定正確的原核重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)，并采用SDS-PAGE、Western-blot等方法對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。 4．以陽離子聚合物法將真核重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入中國

6、倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)中表達(dá)，通過RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)及熒光顯微鏡觀察來確定轉(zhuǎn)染效率。 5．將pEGFP-GDNF注射入BABL/c小鼠后肢肌肉內(nèi)，通過熒光顯微鏡和免疫組織化學(xué)方法觀察體內(nèi)表達(dá)情況。 結(jié)果：①GDNF基因的克隆 從新生大鼠腦組織中成功提取總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA后，PCR擴(kuò)增的GDNF目的基因?yàn)?36bp，與克隆載體連接構(gòu)建克隆重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定得到一條與目的基因大小一致的條帶和一條載體

7、帶，測序后發(fā)現(xiàn)，目的基因序列與Genebank上發(fā)表的GDNF基因序列完全一致。 ②GDNF基因的原核表達(dá) 為了獲得GDNF基因的表達(dá)產(chǎn)物，成功將克隆質(zhì)粒亞克隆至原核表達(dá)載體pET32a中，重組原核表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在蛋白電泳圖譜可以看到明顯的目的蛋白條帶，Western-blot的特異條帶也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。 ③GDNF基因的真核表達(dá) 成功將克隆質(zhì)粒亞克隆至pEGFP-C1真核表達(dá)載體中，將真核重組表

8、達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后，經(jīng)RT-PCR鑒定和熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞液經(jīng)擴(kuò)增得到目的條帶，在熒光顯微鏡下經(jīng)藍(lán)光激發(fā)，可以觀察到CHO細(xì)胞胞漿內(nèi)呈現(xiàn)綠色熒光，將小鼠后肢肌肉的石蠟切片進(jìn)行胰蛋白酶抗原修復(fù)后，在熒光顯微鏡下觀察到散在的綠色熒光，免疫組化染色可以看到肌纖維細(xì)胞周圍有黃色的斑點(diǎn)，以上結(jié)果提示EGFP基因及GDNF基因的進(jìn)一步表達(dá)，說明目的基因片段已成功表達(dá)。 結(jié)論：①本研究利用分子生物學(xué)技術(shù)，成功的克隆了大鼠GDNF基因

9、，測序結(jié)果證明與Gelaebank發(fā)表的序列完全一致。 ②將克隆至pGE-T載體中的GDNF基因亞克隆至原核表達(dá)載體pET32a中，并在E.coliBL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot分析，表明目的基因獲得了表達(dá)。 ③將重組質(zhì)粒pGEM-TGDNF中的GDNF基因亞克隆至pEGFP-C1真核表達(dá)載體中，成均的構(gòu)建出真核重組表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-GDNF，以陽離子聚合物介導(dǎo)法將真核重組表

10、達(dá)質(zhì)粒pEGFP-GDNF轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞中，通過RT-PCR檢測法、熒光檢測和免疫細(xì)胞化學(xué)檢測法證實(shí)GDNF基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中獲得了表達(dá)。再將真核重組表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-GDNF注入BALB/c小鼠后肢肌肉中，同時(shí)設(shè)pEGFP-C1對照組，通過熒光檢測法和免疫組織化學(xué)檢測法證實(shí)了GDNF基因在小鼠肌肉中獲得了表達(dá)。原核和真核重組表達(dá)質(zhì)粒的成功構(gòu)建，為進(jìn)一步獲得重組活性的GDNF蛋白和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基礎(chǔ)和臨床的基因治療研究奠定了基礎(chǔ)。