利用條件基因剔除技術(shù)研究Smad4基因在軟骨內(nèi)成骨過程中的功能.pdf

1、中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所博士學(xué)位論文利用條件基因剔除技術(shù)研究Smad4基因在軟骨內(nèi)成骨過程中的功能姓名：張繼帥申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：遺傳學(xué)指導(dǎo)教師：楊曉20040517摘要分子可以促進(jìn)靜止軟骨細(xì)胞分化，刺激增殖軟骨細(xì)胞增殖，抑制軟骨細(xì)胞肥大分化，并提示Smad4介導(dǎo)的信號(hào)可能作為調(diào)控生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞極，K排列的形態(tài)發(fā)生素維持生長(zhǎng)板軟骨的正常組織結(jié)構(gòu)。我們還研究了阻斷Smad4介導(dǎo)的BMP、TGF一6信號(hào)對(duì)其它調(diào)控骨骼發(fā)

2、育過程的關(guān)鍵信號(hào)通路的影響。原位雜交和免疫組化結(jié)果顯示，Smad4基因剔除導(dǎo)致Ihh、Ptc、PTHrP、PPR基因的表達(dá)顯著降低，提示基因剔除小鼠中Ihl，PTHrP信號(hào)通路的功能減弱。研究還發(fā)現(xiàn)Smad4基因剔除導(dǎo)致了FGF信號(hào)的功能相對(duì)增強(qiáng)，生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞p21分子表達(dá)水平升高以及STAT一1分子主要位于細(xì)胞核內(nèi)。利用VonKossa染色觀察小鼠骨骼礦化情況，發(fā)現(xiàn)基因剔除小鼠的骨領(lǐng)位置較高，緊鄰增殖區(qū)軟骨細(xì)胞。原位雜交檢測(cè)成骨細(xì)胞

3、的標(biāo)志分子骨橋素和骨鈣素，發(fā)現(xiàn)它們的表達(dá)位置比它們?cè)趯?duì)照小鼠的表達(dá)位置升高。這些結(jié)果表明基因剔除小鼠中軟骨膜細(xì)胞提前分化為成骨細(xì)胞。為了驗(yàn)證Smad4介導(dǎo)的信號(hào)是否直接通過調(diào)節(jié)IhlVPTHrP信號(hào)通路控制軟骨細(xì)胞的肥大分化，我們進(jìn)行了胚胎期跖骨體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示Smad4基因剔除的跖骨失去了對(duì)BMP和TGFB信號(hào)的反應(yīng)，但仍能應(yīng)答Ihh替代分子Shh的作用，對(duì)照和基因剔除跖骨軟骨細(xì)胞的肥大分化均受到Shh的明顯抑制。這些結(jié)果表明基

4、因剔除小鼠中Ihh／PTHrP信號(hào)通路的功能『F常，Smad4抑制軟骨細(xì)胞肥大分化的作用不依賴于Ihth／PTHrP信號(hào)通路。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果首次提供體內(nèi)的遺傳學(xué)證據(jù)證明Smad4分子是維持生長(zhǎng)板軟骨『F常組織結(jié)構(gòu)所必需的。Smad4介導(dǎo)的信號(hào)促進(jìn)靜止軟骨細(xì)胞分化，刺激增殖軟骨細(xì)胞增殖，不依賴于Ihh／PTHrP信號(hào)通路抑制軟骨細(xì)胞肥大分化。軟骨組織特異性Smad4基因剔除小鼠的成功研制為進(jìn)一步深入研究Smad4介導(dǎo)的TGF—B信號(hào)在軟骨