羥基紅花黃色素A促進(jìn)激素誘導(dǎo)兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化及其MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　探討羥基紅花黃色素A(HSYA)促進(jìn)激素誘導(dǎo)的股骨頭缺血壞死模兔股骨頭髓內(nèi)及離體兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)成骨分化及其MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.健康成年新西蘭大白兔48只，抽簽法隨機(jī)分為空白組、模型組，模型組采用臀肌注射醋酸潑尼松龍(7.5mg/kg)結(jié)合強(qiáng)迫立位制備激素性股骨頭缺血壞死模型。造模成功后抽簽法將模型組兔隨機(jī)分為模型對(duì)照組、髓芯減壓組、生理鹽水+髓芯減壓組、HSY

2、A+髓芯減壓組，髓芯減壓組僅行髓芯減壓術(shù)，生理鹽水+髓芯減壓組采用髓芯減壓術(shù)配合髓腔內(nèi)注射生理鹽水，HSYA+髓芯減壓組采用髓芯減壓術(shù)配合髓腔內(nèi)注射HSYA，空白組和模型對(duì)照組不作治療。1周后兔麻醉，腹主動(dòng)脈采血，采用化學(xué)比色法、氧化酶法檢測各組兔血清中堿性磷酸酶、甘油三脂的含量;取出股骨頭，光學(xué)顯微鏡、透射電子顯微鏡觀察各組兔股骨頭的形態(tài)結(jié)構(gòu);RT-PCR檢測各組兔股骨頭中Cbfα1及Collagen-ⅠmRNA的表達(dá);Western

3、Blotting檢測各組兔股骨頭中p-ERK、p-JNK和p-P38蛋白的表達(dá)。
　　2.健康成年新西蘭大白兔36只，無菌條件下于脛骨上端內(nèi)側(cè)骨髓腔穿刺抽取骨髓血，分離、體外培養(yǎng)BMSCs，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記物結(jié)合成骨、成脂誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)對(duì)其鑒定。取第3代生長良好的BMSCs，抽簽法隨機(jī)分為空白組，模型組及HSYA低、中、高劑量組。模型組用大劑量地塞米松誘導(dǎo)BMSCs成脂分化，HSYA低、中、高劑量組加入地塞米松的同時(shí)分別加入

4、不同濃度的HSYA;空白組無特殊處理。6d后，透射電子顯微鏡觀察各組細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，檢測細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶、甘油三脂的含量，RT-PCR檢測細(xì)胞中Cbfα1及Collagen-ⅠmRNA的表達(dá)，WesternBlotting檢測細(xì)胞中p-ERK、p-JNK和p-P38蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.HSYA促進(jìn)激素誘導(dǎo)兔BMSCs成骨分化及其MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的在體實(shí)驗(yàn):
　　(1)血清中成骨標(biāo)志物堿性磷酸酶、成脂標(biāo)

5、志物甘油三脂含量的檢測:干預(yù)1周后，空白組、髓芯減壓組、生理鹽水+髓芯減壓組和HSYA+髓芯減壓組兔血清中堿性磷酸酶含量明顯高于模型對(duì)照組，甘油三脂含量明顯低于模型對(duì)照組（P＜0.05）。其中HSYA+髓芯減壓組堿性磷酸酶含量明顯高于髓芯減壓組和生理鹽水+髓芯減壓組（P＜0.05），甘油三脂含量明顯低于髓芯減壓組和生理鹽水+髓芯減壓組（P＜0.05）。
　　(2)光鏡觀察股骨頭組織的病理改變:空白組軟骨下骨小梁致密，排列規(guī)則整齊;

6、骨細(xì)胞清晰，核位于中央，較大;髓腔內(nèi)可見增生活躍的骨髓組織，造血細(xì)胞豐富。模型對(duì)照組軟骨層變薄、結(jié)構(gòu)紊亂，骨小梁較稀疏，部分有斷裂現(xiàn)象，小梁中有骨細(xì)胞壞死;軟骨下區(qū)骨髓內(nèi)脂肪細(xì)胞增多，造血細(xì)胞數(shù)量減少。髓芯減壓組、生理鹽水+髓芯減壓組、HSYA+髓芯減壓組骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)較清晰，骨小梁較多，壞死骨細(xì)胞較模型對(duì)照組少，其中尤以HSYA+髓芯減壓組最為明顯。
　　(3)透射電鏡觀察股骨頭組織的超微結(jié)構(gòu):空白組軟骨細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，無明顯脫

7、顆粒;線粒體較多，嵴結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯斷裂;染色質(zhì)分布相對(duì)均勻，細(xì)胞表面突起較多。模型對(duì)照組空泡樣變較空白組明顯增多，異染色質(zhì)部分邊聚，胞內(nèi)可見較大脂滴或次級(jí)溶酶體。HSYA+髓芯減壓組空泡樣變明顯減少，次級(jí)溶酶體明顯減少，大部分線粒體嵴存在。
　　(4)股骨頭中成骨標(biāo)志物Cbfα1及Collagen-ⅠmRNA的表達(dá):干預(yù)1周后，空白組、髓芯減壓組、生理鹽水+髓芯減壓組和HSYA+髓芯減壓組明顯高于模型對(duì)照組（P＜0.05）。其

8、中HSYA+髓芯減壓組明顯高于髓芯減壓組和生理鹽水+髓芯減壓組（P＜0.05）。
　　(5)股骨頭中與MAPK信號(hào)通路相關(guān)的p-ERK、p-JNK和p-P38蛋白的表達(dá):干預(yù)1周后，空白組、髓芯減壓組、生理鹽水+髓芯減壓組和HSYA+髓芯減壓組p-ERK1、p-ERK2蛋白表達(dá)明顯高于模型對(duì)照組（P＜0.05），p-JNK、p-P38蛋白表達(dá)明顯低于模型對(duì)照組（P＜0.05）。其中HSYA+髓芯減壓組p-ERK1、p-ERK2蛋白

9、表達(dá)明顯高于髓芯減壓組和生理鹽水+髓芯減壓組（P＜0.05），p-JNK、p-P38蛋白表達(dá)明顯低于髓芯減壓組和生理鹽水+髓芯減壓組（P＜0.05）。
　　2.HSYA促進(jìn)激素誘導(dǎo)兔BMSCs成骨分化及其MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的離體實(shí)驗(yàn):
　　(1)油紅“O”染色結(jié)果:空白組未發(fā)現(xiàn)紅染的脂肪顆粒;模型組發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的胞漿內(nèi)可見大量染成紅色的脂肪滴，呈誘導(dǎo)后的脂肪細(xì)胞形態(tài);HSYA低、中、高劑量組發(fā)現(xiàn)有脂肪滴分布，三組紅染脂肪滴明顯

10、少于模型組，HSYA高劑量組脂肪滴明顯少于模型組，少于中、低劑量組。
　　(2)透射電鏡觀察BMSCs的超微結(jié)構(gòu):各組細(xì)胞干預(yù)6d后，空白組細(xì)胞呈橢圓形或不規(guī)則狀，細(xì)胞質(zhì)少，核大，未見明顯脫顆粒現(xiàn)象。模型組細(xì)胞呈長梭形，未見明顯核仁;細(xì)胞器中線粒體較多呈空泡，可見較多次級(jí)溶酶體或脂滴。HSYA低劑量組表面空泡不太明顯，損傷的線粒體數(shù)量較模型組少，脂滴減少。HSYA中劑量組線粒體較低劑量組增多，空泡樣變化減少，次級(jí)溶酶體減少，未見明

11、顯脂滴。HSYA高劑量組線粒體明顯增多，空泡樣變明顯減少，次級(jí)溶酶體明顯減少，未見明顯脂滴。
　　(3)BMSCs中成骨標(biāo)志物堿性磷酸酶、成脂標(biāo)志物甘油三脂含量的檢測:各組細(xì)胞干預(yù)6d后，模型組BMSCs內(nèi)堿性磷酸酶含量較空白組明顯下降（P＜0.05），而HSYA各組較模型組均有明顯升高（P＜0.05），且隨著劑量的加大，堿性磷酸酶含量呈上升趨勢。模型組BMSCs內(nèi)甘油三脂含量較空白組明顯升高（P＜0.05），而HSYA各組較模型

12、組均有明顯降低（P＜0.05），且隨著HSYA劑量的加大，甘油三脂含量呈下降趨勢。
　　(4)BMSCs中成骨標(biāo)志物Cbfα1及Collagen-ⅠmRNA的表達(dá):各組細(xì)胞干預(yù)6d后，模型組細(xì)胞內(nèi)Cbfα1、Collagen-ⅠmRNA含量均明顯低于空白組（P＜0.05），而HSYA各組Cbfα1、Collagen-ⅠmRNA含量均明顯高于模型組（P＜0.05），且隨著HSYA劑量的增加，細(xì)胞內(nèi)Cbfα1、Collagen-ⅠmR

13、NA含量呈上升趨勢。
　　(5)BMSCs中與MAPK信號(hào)通路相關(guān)的p-ERK、p-JNK和p-P38蛋白的表達(dá):各組細(xì)胞干預(yù)6d后，模型組細(xì)胞內(nèi)p-ERK1、p-ERK2蛋白表達(dá)明顯低于空白組（P＜0.05），p-JNK、p-P38蛋白表達(dá)明顯高于空白組（P＜0.05），而HSYA各組p-ERK1、p-ERK2蛋白表達(dá)明顯高于模型組（P＜0.05），p-JNK、p-P38蛋白表達(dá)明顯低于模型組（P＜0.05），且隨著HSYA劑量

14、的增加，細(xì)胞內(nèi)p-ERK1、p-ERK2蛋白表達(dá)呈上升趨勢，p-JNK、p-P38蛋白表達(dá)呈下降趨勢。
　　結(jié)論：
　　1.羥基紅花黃色素A(HSYA)能促進(jìn)激素性股骨頭缺血壞死模兔股骨頭髓內(nèi)及離體兔BMSCs內(nèi)成骨標(biāo)志物堿性磷酸酶、Cbfα1、Collagen-Ⅰ的表達(dá)，抑制成脂標(biāo)志物甘油三脂的表達(dá)，抑制激素誘導(dǎo)股骨頭髓內(nèi)及離體兔BMSCs成脂分化，促使其成骨分化。
　　2.HSYA通過激活MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，上調(diào)