帕金森病相關(guān)的神經(jīng)毒素對MEF2D mRNA的影響及其作用的研究.pdf

1、背景及目的:
　　帕金森病是一種嚴(yán)重影響運動功能的神經(jīng)退行性疾病[1]。該病在65歲以上老年人中的發(fā)病率大概在1-2％,影響著全世界數(shù)百萬老齡人群的生活和健康。帕金森病的臨床癥狀主要是靜止性震顫,肌張力增高和運動遲緩,還伴有植物神經(jīng)系統(tǒng)的癥狀和情緒情感的變化。嚴(yán)重者生活不能自理,為家庭和社會增添了沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)和精神心理負(fù)擔(dān)。目前的治療手段主要在于改善臨床癥狀,但是都無法改變該病的進行性進展的步伐。弄清帕金森病的病因以及探索其背后

2、的發(fā)病機制對于家庭和社會來說具有重大意義。帕金森病的病因目前仍然不是十分清楚,研究顯示,衰老與帕金森病的發(fā)病密切相關(guān)。帕金森病的主要病理特點是多巴胺能神經(jīng)元的死亡。研究顯示,一些神經(jīng)毒素能夠特異性的損傷黑質(zhì)致密部的多巴胺能神經(jīng)元。比如,MPTP,6-OHDA,魚藤酮和百草枯等[2,3,4,5,6]。針對神經(jīng)毒素導(dǎo)致帕金森病的分子機制,人們進行了大量的研究工作。有研究證實,自噬和帕金森病的發(fā)病密切相關(guān)。帕金森病相關(guān)的毒劑能夠影響自噬的過程

3、。例如,MPTP,作為線粒體復(fù)合物Ⅰ的抑制劑,可以抑制自噬[7]。6-OHDA能夠上調(diào)黑質(zhì)神經(jīng)元中的LC-3,從而促進大自噬[4,8]。百草枯可以使自噬囊泡在胞內(nèi)堆積[9,10]。所以這些神經(jīng)毒素常用于帕金森病細胞和動物模型的建立。
　　肌細胞增強因子MEF2D是一種轉(zhuǎn)錄因子,是自噬的底物之一。有研究證實,MEF2D是神經(jīng)元存活的重要調(diào)節(jié)因子,和帕金森病的發(fā)病密切相關(guān)[11,12]。MEF2D作為轉(zhuǎn)錄因子,可以參與細胞核和線粒體的

4、基因轉(zhuǎn)錄表達,若MEF2D的水平下降,則導(dǎo)致神經(jīng)元死亡,所以MEF2D在多巴胺能神經(jīng)元的存活中起著關(guān)鍵性的作用。前期研究發(fā)現(xiàn)毒素應(yīng)激可通過磷酸化修飾MEF2D加速其降解[13,14]。但是,前人的研究主要集中在神經(jīng)毒素對MEF2D的翻譯后修飾水平的研究。是否存在神經(jīng)毒素對MEF2D其他調(diào)節(jié)途徑目前尚無報道。神經(jīng)毒素能否通過影響MEF2D mRNA的水平而影響其蛋白的表達水平呢?因此,我們進行了本實驗,以探究神經(jīng)毒素對MEF2D mRNA

5、表達水平的影響,并進一步探究神經(jīng)毒素對MEF2D mRNA穩(wěn)定性的影響和MEF2D mRNA的變化對細胞存活死亡的作用。
　　方法:
　　本實驗首先在多巴胺能神經(jīng)元細胞系SN4741細胞中,采用神經(jīng)毒素MPP+處理,通過實時定量PCR技術(shù)檢測不同時間點的MEF2D mRNA的變化。然后利用體內(nèi)帕金森病模型進一步驗證細胞學(xué)實驗結(jié)果。在C57小鼠中,腹腔注射神經(jīng)毒素MPTP造成小鼠亞急性帕金森病模型,通過激光捕獲顯微切割的方法選

6、擇性的切取酪氨酸羥化酶(TH)陽性的神經(jīng)元,然后通過實時定量PCR技術(shù)特異性地檢測多巴胺能神經(jīng)元中MEF2D mRNA的變化。進一步,通過放線菌素D抑制基因轉(zhuǎn)錄實驗,探索神經(jīng)毒素對MEF2D mRNA穩(wěn)定性的影響。隨后,通過慢病毒感染的方法將細胞中的MEF2D mRNA降低,通過流式細胞儀檢測和蛋白電泳觀察MEF2D mRNA的降低對神經(jīng)元存活死亡的作用。
　　結(jié)果:
　　實驗一:帕金森病相關(guān)的神經(jīng)毒素對MEF2D mRNA

7、水平的影響
　　(1)在SN4741細胞中,加入50uM的神經(jīng)毒素MPP+后12小時,24小時和36小時分別收集細胞檢測,免疫細胞熒光和蛋白電泳結(jié)果顯示,和對照組相比,MPP+組的MEF2D蛋白水平下降。然后,提取分離細胞中的mRNA,實時定量PCR結(jié)果顯示,和對照組相比,MPP+組的MEF2D mRNA水平也下降,和蛋白水平的下降趨勢相一致。
　　(2)C57小鼠腹腔注射MPTP構(gòu)建帕金森病亞急性模型。第一次腹腔注射MPT

8、P后3天和5天處死小鼠,取腦切片染色進行相關(guān)實驗。免疫組織熒光染色結(jié)果顯示,和對照組相比,TH陽性的神經(jīng)元的數(shù)目明顯下降,表明小鼠亞急性帕金森模型構(gòu)建成功。采用快速染色和激光捕獲顯微切割特異性地切取TH陽性的神經(jīng)元后,提取RNA,實時定量PCR的結(jié)果顯示,和對照組相比,MPTP組的MEF2D mRNA顯著下降(Р<0.01)。
　　實驗二:帕金森病相關(guān)的神經(jīng)毒素對MEF2D mRNA穩(wěn)定性的影響以及MEF2D mRNA水平的變化對

9、神經(jīng)元存活的作用
　　(1)放線菌素D能夠快速有效的抑制基因轉(zhuǎn)錄,常用于mRNA半衰期的檢測。通過放線菌素D抑制基因轉(zhuǎn)錄實驗,我們發(fā)現(xiàn),放線菌素D單獨處理組的MEF2D mRNA半衰期為1.5小時,而同放線菌素D和MPP+聯(lián)合處理組的MEF2D mRNA半衰期為0.6小時,兩組之間有顯著差異,Р<0.01。表明MPP+影響了MEF2D mRNA的穩(wěn)定性。
　　(2)慢病毒shRNA-MEF2D感染后,通過半定量PCR證實了慢

10、病毒的干擾效果。隨后,通過流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn),對照組的凋亡細胞比例為0.4%,空病毒載體FUGW組的凋亡細胞比例為0.5%,而shRNA-MEF2D組的凋亡細胞比例為14%。這說明,單獨干擾MEF2D mRNA水平就能夠誘導(dǎo)細胞凋亡。
　　(3)在神經(jīng)毒素MPP+處理條件下,活化的caspase3的水平顯示,和正常對照組和FUGW組相比,shRNA-MEF2D組的活化的caspase3的量明顯增高。這說明,降低MEF2D mRNA

11、能夠使細胞對MPP+的毒性更加敏感。
　　結(jié)論:
　　本實驗主要的創(chuàng)新點在于發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)毒素調(diào)控MEF2D的新途徑,即在轉(zhuǎn)錄水平上對MEF2D進行調(diào)控。另外,運用了當(dāng)今先進的激光捕獲顯微切割技術(shù),能夠特異性地獲取目的細胞,排除了周圍細胞的干擾,確保了實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。
　　(1)在SN4741細胞系和C57小鼠帕金森病模型中,帕金森病相關(guān)的神經(jīng)毒素能夠使MEF2D mRNA降低。MEF2D mRNA的降低是和其蛋白水平的