響應(yīng)鹽脅迫黃瓜韌皮部蛋白CsCML1基因的表達(dá)與功能初步分析.pdf

1、黃瓜是世界性的重要蔬菜作物，也是我國設(shè)施栽培的主要蔬菜作物之一，但由于黃瓜根系分布較淺，再生能力弱，對土壤鹽漬化敏感。近年來日益嚴(yán)重的設(shè)施土壤次生鹽漬化已嚴(yán)重影響了黃瓜的生長、產(chǎn)量和品質(zhì)，如何提高黃瓜的耐鹽性受到廣泛關(guān)注。CML是一類植物細(xì)胞所特有的Ca2+響應(yīng)蛋白家族，參與了植物許多重要的對逆境脅迫的響應(yīng)，CsCML1(Calmodulin-like protein1-like)是前期研究已知的響應(yīng)鹽脅迫重要的黃瓜韌皮部鈣結(jié)合蛋白，了

2、解其特征和功能對于黃瓜的耐鹽栽培和育種均具有一定的意義。
　　本研究在前期研究基礎(chǔ)上，首先克隆CsCML1基因的開放閱讀框(ORF)序列，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，檢測了鹽脅迫下CsCML1基因在根莖葉中的表達(dá)模式。以CsCML1基因?yàn)槟康幕颍瑯?gòu)建植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，通過對轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行耐鹽性鑒定，初步分析了CsCML1的功能。主要研究結(jié)果如下:
　　1、采用PCR技術(shù)從黃瓜中克隆出一條573

3、 bp的CsCML1基因的開放閱讀框，理化性質(zhì)分析顯示該基因編碼190個(gè)氨基酸，編碼蛋白為穩(wěn)定蛋白，親水部分大于疏水部分，并含有4個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)。CsCML1的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是α-螺旋，其次是無規(guī)則卷曲。氨基酸同源分析表明黃瓜CsCML1與香瓜CmCML32同源性較高，達(dá)到95％;
　　2、通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)CsCML1在‘新泰密刺’黃瓜品種的根、莖、葉中均有表達(dá)，在根中的表達(dá)量最大，其次是莖和葉。對其進(jìn)行75m

4、mol·L-1 NaC1處理，發(fā)現(xiàn)根、莖、葉中的CsCML1基因表達(dá)量均不同程度上調(diào)，根和葉的表達(dá)量在48 h時(shí)出現(xiàn)高峰，分別為對照的0.84倍和2.62倍，莖在24 h時(shí)的表達(dá)量最高，為CK的2.15倍。因此黃瓜CsCML1基因受鹽脅迫誘導(dǎo)并表達(dá);
　　3、酶切目的基因和植物表達(dá)載體pCambia2301，連接后通過熱激法導(dǎo)入大腸桿菌DH5α，得到了pCambia2301-CsCML1大腸桿菌表達(dá)載體;
　　4、將表達(dá)載體

5、通過凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌(GV3101)，并采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將CsCML1基因轉(zhuǎn)入擬南芥，篩選獲得抗性植株，PCR驗(yàn)證獲得轉(zhuǎn)基因植株;
　　5、轉(zhuǎn)基因擬南芥通過qRT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)不同轉(zhuǎn)基因株系中CsCML1基因的表達(dá)量有區(qū)別，篩選出過表達(dá)株系CsCML1-3;
　　6、對高表達(dá)株系進(jìn)行耐鹽性分析發(fā)現(xiàn):鹽處理下的轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的萌發(fā)率低于野生型，隨著鹽處理濃度增加差異更加顯著。隨著鹽濃度的增加，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的根長也明顯