p300及其結合功能在缺氧神經細胞損傷中的作用.pdf

1、缺氧是許多疾病所共有的一個基本病理過程。是臨床醫(yī)學、高原醫(yī)學、航空航天醫(yī)學等研究的核心問題。研究缺氧發(fā)生和發(fā)展的規(guī)律以及缺氧習服機制，對于保障高原建設者和世居高原人群的健康、邊疆地區(qū)的經濟發(fā)展、鞏固國防以及拓寬人類生存空間具有重要的現(xiàn)實意義。腦是機體內各系統(tǒng)缺氧反應的主宰者，只有在腦組織功能正常的情況下，才有可能通過呼吸、循環(huán)、血液等系統(tǒng)建立起一整套適應缺氧環(huán)境的代償機制，因此，缺氧中樞神經系統(tǒng)功能障礙及習服的分子機制是高原醫(yī)學研究的首

2、要問題之一?；虿町惐磉_是調控細胞生命活動的核心機制，是生物體完成基本生命活動以及對外界刺激作出應答的分子基礎。闡明基因選擇性表達所依賴的調控信息及其相互作用的分子機制，已經成為功能基因組學領域內基因表達調控研究國際競爭的焦點。對低氧應激反應相關基因表達及調控信息的認識成為研究缺氧中樞神經系統(tǒng)功能障礙及習服的核心內容之一。 人類基因組系統(tǒng)分析的結果告訴我們，在序列占有量還不到整個基因組2％的蛋白質組中，調節(jié)基因表達的轉錄因子占據

3、了相當大的比例，約3000左右。這些轉錄因子在調控基因表達時相互作用，形成了極為復雜的基因表達調控網絡。從研究單一的調控環(huán)節(jié)拓展到深入探討它們之間的相互聯(lián)系及其控制過程，從調控網絡的角度探尋低氧適應基因及其誘導的調控機制，不僅有助于更深入認識低氧適應的分子機制，而且可為有效預防高原低氧損傷醫(yī)學措施的制定提供更直接的科學依據。 近十年的研究證實，在基因表達調控網絡中，除了轉錄因子這一活躍的因素以外，轉錄輔激活子因其多轉錄因子結合功

4、能，而成為網絡中活躍的因素之一。轉錄輔激活子表達變化及其結合蛋白譜的改變成為聯(lián)系外界信號和基因表達的中心環(huán)節(jié)。轉錄輔激活子p300在缺氧基因表達調控中起重要作用，已發(fā)現(xiàn)多種缺氧相關轉錄因子活性的發(fā)揮依賴p300，p300的蛋白結合功能受外界環(huán)境、細胞環(huán)境的精密調控。我們推測p300蛋白表達量、蛋白結合功能是影響缺氧相關基因的選擇性表達的重要方面。而相關的研究尚未見報導。 本研究以大鼠海馬組織及NPC12細胞為研究對象，探討p30

5、0表達及其結合功能在缺氧神經細胞損傷中的作用。課題分為四個部分：一、比較大鼠p300蛋白表達的細胞、組織和性別差異性；二、利用低壓艙模擬高原5000m低氧環(huán)境，從整體動物水平，闡明缺氧對p300基因表達及其結合功能的影響；三、以NPC12細胞為對象，利用CoCl2處理構建缺氧細胞模型，從細胞水平闡明p300表達變化及其結合功能改變對CoCl2處理細胞損傷的影響；四、利用RNAi技術抑制NPC12細胞中p300的表達，進一步闡明p300表

6、達變化及其結合功能改變對CoCl2處理細胞損傷的影響，并比較了p300表達抑制后，NPC12細胞對CoCl2處理以及低氧培養(yǎng)耐受性變化的差異。 本課題的研究結果如下： 一、大鼠組織中p300蛋白表達及分布特點。運用免疫組織化學技術和免疫印跡技術，對大鼠不同組織中p300蛋白的表達和分布進行檢測，探討p300在組織蛋白差異表達中的作用。結果顯示，p300蛋白在心肌、肝臟、肺臟、腎臟、睪丸、小腦、海馬、大腦皮質中均有分布，定

7、位于核內。睪丸組織里p300主要分布在生精小管外層的精原細胞中，在成熟精子細胞未檢測到陽性表達；腎臟中p300主要分布在髓質上皮細胞；海馬p300主要分布在錐形神經元層；大腦皮質中p300主要分布在皮質神經元，在分子層中表達弱陽性；小腦蒲肯野細胞中p300表達強陽性。肝臟的肝細胞中p300均勻分布，肺臟中p300表達較弱。雌性大鼠p300蛋白在心肌、比目魚肌表達水平高，其次是腎臟、肝臟，在下丘腦中未檢測到明顯的陽性表達；雄性大鼠p300

8、蛋白在心肌、比目魚肌表達水平高，其次是小腦、肝臟和睪丸，在下丘腦中未檢測到明顯的陽性表達；雌性大鼠心肌和腎臟組織中p300蛋白水平高于雄性大鼠。結論：p300是普遍表達的核蛋白，其分布和表達水平有細胞、組織和性別差異性，p300可能在細胞、組織對外界刺激的反應性差異中起作用。 二、缺氧對p300蛋白表達、分布及其結合功能的影響。利用RT-PCR、Westernblot、免疫共沉淀、斑點雜交技術分析模擬海拔5000m連續(xù)缺氧過程中

9、大海馬組織p300表達和結合功能的改變，探討p300在缺氧神經細胞損傷-習服機制中的作用。結果顯示：①缺氧過程中大鼠海馬組織錐形神經元細胞形態(tài)學改變：與平原對照組相比，缺氧1天組海馬組織中未見明顯改變，缺氧5天、15天和30天時，部分神經元體積變小，染色質聚集深染，部分神經元核呈梭形或三角形，固縮深染。②缺氧對大鼠海馬組織中p300分布的影響：缺氧過程中，p300陽性細胞仍然集中在錐形神經元層。③缺氧對大鼠海馬組織中p300mRNA表達

10、的影響：缺氧1天后，p300轉錄水平增加，在缺氧五天時達到高峰，缺氧15天時下降，缺氧30天時較缺氧15天略有上升，但沒有顯著差異。缺氧各組p300mRNA量與平原對照組相比，差異具有顯著意義。④缺氧對大鼠海馬組織中p300蛋白表達的影響：缺氧1天后，p300蛋白水平增加，缺氧各組間的p300蛋白量差異無顯著意義。缺氧各組與平原對照組的差異有顯著意義。⑤缺氧對大鼠海馬組織p300與HIF-1α、p65結合率的影響：p300與HIF-1α

11、結合在缺氧1天時最高，隨后下降；p300與p65結合在平原對照組中最高，在缺氧1天后下降，在缺氧15天時，略有回升，但仍低于平原對照組。⑥缺氧過程中大鼠海馬組織p300結合蛋白譜變化：通過一維電泳的分離結果顯示，各組間蛋白結合的種類有明顯差異。結論：模擬海拔5000m缺氧不僅上調大鼠海馬組織中p300的轉錄和蛋白水平，而且影響p300的蛋白結合功能，提示p300在缺氧海馬的病理生理活動中起作用，蛋白表達增加以及結合蛋白功能的改變p300

12、發(fā)揮作用的兩種方式。 三、CoCl2處理對NPC12p300蛋白的表達和結合功能的影響。以NPC12細胞為細胞模型，利用Westernblot、免疫共沉淀、斑點雜交技術觀察CoCl2處理對p300表達和結合功能的影響及其與NPC12細胞損傷的關系。1、CoCl2(200μmol/L)處理過程中NPC12細胞形態(tài)學變化：對同一視野下細胞的形態(tài)觀察結果顯示，處理后3h，細胞突起增多，胞體變小，隨著處理時間的延長，突起縮短，胞體皺縮，

13、光暈逐漸消失，到48h時大部分細胞裂解、死亡。2、CoCl2(200μmol/L)處理過程中NPC12細胞活力的變化：①LDH釋放率的變化：未處理NPC12細胞，在培養(yǎng)6h時，LDH釋放率下降，與3h時相比差異具有顯著意義，在12h以后，LDH釋放率增加；處理NPC12細胞，LDH釋放率變化呈同樣的變化規(guī)律，但處理12h以后，處理組LDH釋放率顯著高于相應時間點未處理組。②細胞存活率的變化：200μmol/L處理細胞組存活率在24h時顯

14、著高于未處理組細胞，隨后下降。500μmol/L處理細胞組存活率顯著下降，低于相應時間點200μmol/L處理細胞組和未處理組細胞。③MTT法檢測NPC12細胞活力變化：200μmol/L處理細胞組活力在12h顯著低于非處理組細胞，500μmol/L處理細胞組活力顯著低于相應時間點200μmol/L處理細胞組和未處理細胞。3、CoCl2處理對NPC12細胞p300表達和分布的影響：p300蛋白水平在CoCl2處理后6h明顯增加，并持續(xù)高

15、表達至24h，隨后下降，但仍高于處理前。p300表達定位于細胞核內的非核仁區(qū)。4、CoCl2處理NPC12細胞p65的表達和分布的影響：p65蛋白水平在CoCl2處理后3h增加，在6h達到高峰，隨后下降。處理前p65蛋白主要分布在細胞胞漿，在處理后6h，p65向核內轉移，并在隨后處理至24h內在核內和胞漿中均有分布，在處理48h時，部分細胞中核內p65的分布降低。5、CoCl2(200μmol/L)處理過程中NPC12細胞p300與HI

16、F-1α、p65結合率的變化：CoCl2處理過程中，p300與HIF-1的結合在3h時最高，隨后下降，而p300與p65的結合在CoCl2處理過程中下降，在48h時增加。 結論：CoCl2處理上調NPC12p300蛋白表達，影響p300的蛋白結合功能，但p300-p65結合不受p300和p65蛋白水平變化的影響，可能與其它機制有關。p300表達和結合功能的時空變化趨勢與NPC12細胞活力的改變一致，提示p300可能是影響NPC1

17、2細胞CoCl2耐受性的重要因素。 四、干擾p300表達后NPC12細胞對CoC12、低氧培養(yǎng)耐受性的影響。通過RNA干擾抑制p300蛋白表達，觀察NPC12細胞對CoCl2、低氧培養(yǎng)的耐受性改變，探討p300在不同的缺氧模式中的作用差異。 綜上所述，缺氧能上調p300蛋白表達，影響其蛋白結合功能，但p300對CoCl2和低氧處理條件下神經細胞耐受性的影響不同：抑制p300表達，NPC12對CoCl2處理的耐受性增加，但