p300 100kD降解片段通過μ型鈣蛋白酶產(chǎn)生并促進神經(jīng)細胞分化發(fā)育.pdf

1、神經(jīng)發(fā)育是一個通過大量基因在時間和空間上非常精密地表達而被調(diào)控的復(fù)雜過程。這些基因的表達異?？蓪?dǎo)致神經(jīng)發(fā)育紊亂。染色質(zhì)結(jié)構(gòu)能夠整合細胞內(nèi)、外環(huán)境的信息引發(fā)特定的表型產(chǎn)生，是一種調(diào)節(jié)基因精確表達的關(guān)鍵機制。組蛋白乙酰化酶（histone acetyltransferases，HATs）是以空間和時間依賴性形式調(diào)控基因表達水平的蛋白家族之一，其通過乙?；揎椬饔每墒谷旧|(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生動態(tài)改變，并對基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生相應(yīng)的影響。p300作為一種HAT

2、，調(diào)控全身各組織中多種基因的轉(zhuǎn)錄活性，特別在細胞周期進程和細胞分化中發(fā)揮重要功能。除了具有乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，p300還含有許多保守功能結(jié)構(gòu)域通過與其它細胞蛋白相互作用。p300的基本功能是作為HAT或FAT，以及充當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子和基本轉(zhuǎn)錄裝置中其它原件之間的三角架及橋架，易化染色質(zhì)重構(gòu)并激活基因轉(zhuǎn)錄，能對神經(jīng)元中p53羧基末端特異賴氨酸位點乙酰化而促進突起的生長并為軸突再生所必需。p300與另一種HAT即CREB結(jié)合蛋白（CREB-bind

3、ing protein，CBP）非常相似，二者對細胞周期調(diào)控、凋亡、胚胎發(fā)育、細胞分化和腫瘤發(fā)生等多種活動都有影響，并是胚胎發(fā)育，特別是神經(jīng)發(fā)育中均是必不可少的調(diào)控因子。然而，二者也具有一些不同的功能，p300在神經(jīng)分化發(fā)育中的作用不能被CBP所替代。
　　盡管p300在胚胎干細胞和畸胎瘤細胞F9細胞分化中必不可少，但是，在誘導(dǎo)胚胎干細胞擬胚胎形成的分化時，p300 mRNA水平升高但其蛋白水平下降；在視黃酸（retinoic a

4、cid，RA）誘導(dǎo)F9分化過程中，p300的HAT活性顯著增加，但其蛋白水平卻顯著降低，表明在分化過程中p300被大量降解。p300蛋白水平下降與泛素蛋白酶體系統(tǒng)降解有關(guān)，但p300下降后伴隨的HAT活性增強促進細胞分化是否與泛素蛋白酶體系統(tǒng)途徑降解有關(guān)尚不確定。在急性髓性白血病中，CBP/p300發(fā)生降解，而鈣蛋白酶的特異性抑制劑能夠阻斷 CBP/p300的下降，表明p300可被鈣蛋白酶降解。
　　本研究在證明小鼠腦組織和小鼠成

5、神經(jīng)瘤細胞（N2a細胞）分化發(fā)育過程中p300 mRNA表達逐漸增加而全長p300蛋白逐漸減少的基礎(chǔ)上，首次檢測到在神經(jīng)元分化過程中，p300可被μ型鈣蛋白酶特異性剪切而產(chǎn)生大量的約100kD大小的氨基末端片段，并初步證明該片段具有比全長p300更強的促神經(jīng)細胞分化作用。
　　1.小鼠胚腦和 N2a細胞分化發(fā)育過程中p300水平逐漸下降為了明確在神經(jīng)系統(tǒng)分化發(fā)育過程中存在p300轉(zhuǎn)錄水平升高的同時蛋白水平下降這一現(xiàn)象，首先，我們提

6、取E9.5至E16.5小鼠胚胎全腦的蛋白，檢測小鼠胚胎腦分化發(fā)育過程中 p300蛋白水平的變化趨勢。結(jié)果顯示，在小鼠胚胎 E9.5至 E15.5期間，p300的蛋白水平則逐漸下降。繼而，我們對N2a細胞用RA誘導(dǎo)分化0-48h后，應(yīng)用RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測到p300 mRNA和蛋白水平，發(fā)現(xiàn)隨著誘導(dǎo)時間的延長，p300 mRNA逐漸升高而蛋白質(zhì)水平下降。以上結(jié)果說明，在神經(jīng)組織或神經(jīng)細胞分化發(fā)育過程中，同樣存在p

7、300轉(zhuǎn)錄水平升高同時蛋白表達水平下降現(xiàn)象。
　　2.小鼠胚腦和 N2a細胞分化發(fā)育過程中全長 p300蛋白水平下降而 p300100kD裂解片段升高在小鼠胚腦和N2a細胞分化發(fā)育過程中，p300表達水平逐漸下降的現(xiàn)象體提示，p300在神經(jīng)分化中可能被大量降解。為此，應(yīng)用識別p300氨基末端的抗體對不同胚齡小鼠腦組織和經(jīng) RA誘導(dǎo)不同時間的N2a細胞中全長p300（full length p300, FL-p300）及其降解產(chǎn)物的

8、水平變化情況進行Western blot檢測。結(jié)果顯示，在約100kD大小處可見一明顯降解片段——p300100kD片段（100kD fragment of p300,100kD p300）。該降解片段水平在E9.5至E12.5腦中以及RA誘導(dǎo)分化的0至2d的N2a細胞中隨著FL-p300水平的逐漸降低而上升；在E13.5至E16.5期間，則與FL-p300同步下降。
　　3.產(chǎn)生100kD p300的裂解位置在p300氨基酸72

9、6-1020區(qū)域100kD p300能被識別 p300氨基末端的抗體識別，根據(jù)分子量計算其產(chǎn)生位置應(yīng)在 p300氨基末端1/3處。由于p300的同源蛋白CBP在細胞分化過程中沒有類似于p300基因轉(zhuǎn)錄增加而蛋白水平降低的現(xiàn)象，且盡管CBP和p300的序列一致性高達60％，但在氨基末端1/3處二者序列相似度很低，因此我們以同源蛋白CBP做對照來確定100kD p300的裂解位置。根據(jù)CBP和p300的氨基末端1/3處可能裂解位置處的氨基酸

10、序列，構(gòu)建表達FL-p300裂解位點競爭性底物的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染N2a后用RA誘導(dǎo)36h。Western blot檢測顯示，轉(zhuǎn)染表達CBP(aa777-974)短片段（CBP short fragment，CBP S）和CBP（aa726-1020）長片段（CBP long fragment，CBP L）的細胞，100kD p300的產(chǎn)生與轉(zhuǎn)染表達HA的細胞無明顯區(qū)別，而轉(zhuǎn)染表達p300（aa777-974）短片段（p300 short fr

11、agment，p300 S）和p300（aa726-1020）長片段（p300 long fragment，p300 L）的細胞，100kD p300的產(chǎn)生較轉(zhuǎn)染表達HA的細胞減少，即p300 S和p300 L能抑制RA誘導(dǎo)分化過程中100kD p300的產(chǎn)生，且以p300 L的抑制作用更明顯。對 RA誘導(dǎo) N2a細胞突起生長（神經(jīng)細胞分化的標(biāo)志之一）作用的比較顯示，p300 S和p300 L對RA誘導(dǎo)的N2a突起生長也具有抑制作用，并

12、以p300 L的抑制作用更顯著。由此表明，產(chǎn)生100 kD p300的裂解位置在p300氨基酸726-1020區(qū)域，并提示p300在此區(qū)域的裂解可促進神經(jīng)細胞的分化。
　　4.μ型鈣蛋白酶是產(chǎn)生100kD p300的剪切酶為了尋找產(chǎn)生100kD p300的剪切酶，首先觀察了蛋白酶體抑制劑MG132和鈣蛋白酶抑制劑calpeptin對分化誘導(dǎo)N2a細胞產(chǎn)生100kD p300的影響。在5%FBS完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的未分化N2a細胞中，M

13、G132和calpeptin對p300的降解和100 kD p300的產(chǎn)生沒有影響，而在含RA培養(yǎng)基培養(yǎng)的N2a細胞中，MG132雖可阻斷p300的降解，卻不影響100kD p300的產(chǎn)生；而calpeptin抑制FL-p300降解的同時也抑制了100kD p300的產(chǎn)生。由此說明calpain是100kD p300產(chǎn)生的剪切酶。
　　根據(jù)激活時所需 Ca2+濃度數(shù)量級不同，鈣蛋白酶家族分為μ型鈣蛋白酶（微摩爾級）和m型鈣蛋白酶（

14、毫摩爾級）兩類。為了明確μ型鈣蛋白酶和m型鈣蛋白酶對p300的剪切及100kD p300的產(chǎn)生是否具有不同的影響，使用5μmol/L和5 mmol/L兩種數(shù)量級濃度的Ca2+分別激活體外的μ型鈣蛋白酶和m型鈣蛋白酶來比較兩種鈣蛋白酶對小鼠E13.5胚胎全腦蛋白中p300裂解的差異。免疫印跡技術(shù)檢測顯示，隨著濃度的升高，m型鈣蛋白酶雖然可促進FL-p300裂解，但對100kD p300的產(chǎn)生沒有影響，而μ型鈣蛋白酶既可促進FL-p300的

15、裂解也可促進100kD p300的形成，其最適濃度范圍為0.01 U/μl~0.02 U/μl。當(dāng)在加入0.003 U/μl或0.01 U/μl的μ型鈣蛋白酶同時加入10μmol/L calpeptin，對FL-p300的剪切被明顯抑制，尤其是對0.01 U/μlμ型鈣蛋白酶抑制效果更為明顯。因此，μ型鈣蛋白酶是產(chǎn)生100kD p300的剪切酶。
　　在N2a細胞轉(zhuǎn)染表達氨基末端鏈接標(biāo)簽HA的p300后提取蛋白，用μ型鈣蛋白酶進行

16、酶切，用HA標(biāo)簽抗體進行Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，μ型鈣蛋白酶剪切p300產(chǎn)生的100kD p300片段帶有HA標(biāo)記，加入calpeptin可抑制帶HA的100kD片段產(chǎn)生。因此，μ型鈣蛋白酶對p300進行剪切的位點位于p300氨基末端1/3處。
　　進一步應(yīng)用Western blot對發(fā)育過程中小鼠胚胎腦蛋白中μ型鈣蛋白酶水平的變化進行檢測顯示，從E9.5至E15.5，腦內(nèi)μ型鈣蛋白酶激活型大亞基水平逐漸升高，表明胚胎發(fā)

17、育過程中100kD p300產(chǎn)生的逐漸增加與μ型鈣蛋白酶活性逐漸增強有關(guān)。
　　5.100kD p300促進N2a細胞的分化發(fā)育為了了解分化發(fā)育中FL-p300被剪切產(chǎn)生100kD片段的可能功能意義，繼而分析了過表達不同p300片段對N2a細胞分化發(fā)育的影響。結(jié)果顯示，過表達p300氨基末端片段（aa9-1007，p300 N）能顯著促進N2a細胞突起的生長和GAP43蛋白水平上升；過表達p300羧基末端片段（aa1006-241

18、4，p300 C）可促進N2a細胞中p53乙?；?，但對N2a細胞突起生長和GAP43蛋白水平上升無明顯影響。而共同過表達p300 N和p300 C，其促進突起生長和 GAP43蛋白水平上升的作用較弱，與過表達全長 p300類似或略弱于全長p300，明顯弱于p300 N；促進p53乙?；淖饔脧娪谌Lp300，但明顯低于p300 C。由此表明，p300促進神經(jīng)分化的功能主要由p300氨基末端100kD片段完成，p300羧基末端片段具有較強